Summary

Dosage d’adhérence dynamiques pour l’analyse fonctionnelle des thérapies contre les adhérences dans la maladie intestinale inflammatoire

Published: September 20, 2018
doi:

Summary

Dynamique adhérence de cellules immunitaires vers la paroi du vaisseau est une condition préalable pour la domiciliation de l’intestin. Nous présentons ici un protocole pour une analyse fonctionnelle in vitro pour l’analyse de l’impact des anticorps anti-intégrine, chimiokines ou d’autres facteurs sur l’adhérence cellulaire dynamique de cellules humaines à l’aide d’enduit de loopbackDans capillaires.

Abstract

Tube digestif homing des cellules immunitaires est important pour la pathogenèse des maladies inflammatoires de l’intestin (MII). Adhérence cellulaire intégrine dépendant d’addressins est une étape cruciale dans ce processus et stratégies thérapeutiques interférant avec l’adhérence ont été établis avec succès. L’anticorps de l’intégrine anti-α4β7, vedolizumab, est utilisé pour le traitement clinique de la maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (Cu) et autres composés sont susceptibles de suivre.

Les détails de la procédure d’adhésion et les mécanismes d’action des anticorps anti-intégrine sont encore peu clairs à bien des égards en raison des techniques limitées disponibles pour la recherche fonctionnelle dans ce domaine.

Nous présentons ici un essai d’adhérence dynamiques pour l’analyse fonctionnelle de l’adhérence de cellules humaines dans des conditions de circulation et de l’impact des thérapies anti-intégrine dans le contexte des MICI. Il repose sur la perfusion des cellules humaines primaires par l’intermédiaire de capillaires en verre ultrafin rence-enduit avec analyse microscopique en temps réel. Le test offre une variété de possibilités d’améliorations et modifications et détient le potentiel de découvertes mécanistes et applications translationnelles.

Introduction

Motion de la cellule est un processus fortement réglementé indispensable pour le développement et le fonctionnement des organismes multicellulaires, mais est également impliquée dans la pathogénie d’une multitude de maladies1. Récemment, le processus de retour des cellules immunitaires dans la circulation sanguine vers les tissus périphériques a gagné une attention croissante, car il contribue à la reconstitution et l’expansion des cellules pathogènes dans les tissus enflammés dans les maladies à médiation immunologique par2 ,3. En particulier, homing s’est avéré ont intérêt translationnelle dans les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI). La thérapeutique anti-α4β7 intégrine anticorps vedolizumab interférant avec homing gut a montré une efficacité dans des essais cliniques à grande échelle4,5 et a été utilisé avec succès dans la pratique clinique réelle6,7 , 8. autres composés sont susceptibles de suivre9,10. De même, l’anticorps de l’intégrine thérapeutique anti-α4, natalizumab, est utilisé pour le traitement de la sclérose en plaques (MS)11.

Toutefois, notre compréhension fonctionnelle du processus contrechamp en général et le mécanisme d’action de ces anticorps thérapeutiques en particulier est encore limitée. Il est bien établi que homing consiste en plusieurs étapes, y compris la cellule attachant et roulant avec adhérence de cellules suivantes conduisant à l’arrestation ferme suivie de trans migration endothéliales12,13. Les anticorps susmentionnés neutralisent des intégrines à la surface cellulaire empêchant l’interaction avec les addressins sur l’endothélium de la paroi des vaisseaux. Ceci est pensé pour empêcher la cellule ferme adhésion14,15. Pourtant, nous commençons seulement à comprendre la pertinence différentielle des intégrines spécifiques pour la domiciliation de cellule de sous-ensembles distincts de cellules. En outre, les effets des anticorps anti-intégrine sur différents sous-ensembles de cellules et les associations de dose-réponse sont largement méconnues, menant à beaucoup de questions en suspens dans le domaine des thérapies de radioralliement et contre les adhérences intestinale dans les MICI.

Par conséquent, des outils pratiques pour répondre à ces questions sont absolument nécessaires. L’effet des anticorps anti-intégrine sur l’interaction de l’intégrine-rence a jusqu’ici surtout été évalué en évaluant l’inhibition de l’efficacité/liaison liaison avec écoulement cytometry ou par adhérence statique dosages16,17 ,19,18,20, donc avec la simplification apparente et l’écart par rapport à la situation physiologique. Nous avons récemment mis en place un test d’adhérence dynamiques pour étudier l’adhésion intégrine-dépendante des cellules humaines à addressins et les effets des anticorps anti-intégrine sous la contrainte de cisaillement2. Le principe de la technique a été montré plus haut avec la souris les cellules21,22. Ici, il a été adapté et développé pour répondre aux questions mentionnées ci-dessus translationnelles, ouverture nouvelles avenues afin de mieux comprennent les mécanismes du traitement avec des anticorps anti-intégrine in vivo.

Protocol

Les études décrites dans les sections suivantes ont été réalisées d’après approbation du Comité d’éthique de l’Université Friedrich-Alexander Erlangen-Nuremberg. 1. préparation des capillaires Connecter les capillaires rectangulaires au tuyau en caoutchouc en étirant le tube sur un côté avec des petits ciseaux et en insérant doucement le tube capillaire (environ 0,5 cm) dans le tube. Rendre étanche la liaison entre le tube avec le film plastique paraffine et des…

Representative Results

La méthode présentée dans ce manuscrit a pour but de simuler le processus in vivo de l’adhérence de cellules humaines à la paroi endothéliale aussi étroitement que possible à fonctionnellement évaluer adhésion cellulaire et le rôle des anticorps interférentes. Par conséquent, ultraminces capillaires sont recouverts d’addressins et perfusés avec des cellules humaines fluorescent étiquetés d’intérêt à l’aide d’une pompe à perfusion. L’adhérence des …

Discussion

Le protocole ci-dessus décrit une technique utile pour étudier la dynamique adhérence de cellules immunitaires humaines aux ligands endothéliales. Par variation de ligands enduits types cellulaires perfusé ou sous-ensembles, incubation avec des stimuli additionnels ou différents anticorps neutralisants, il a presque illimité d’applications potentielles. Par conséquent, ces tests d’adhérence dynamique peuvent être utiles de répondre à deux questions fondamentales de recherche fondamentale et translationnel…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La recherche du CN, IA, traitement NPF et SZ a été appuyée par le Centre interdisciplinaire de recherche clinique (IZKF) et le programme ELAN de l’université Erlangen-Nuremberg, l’autre Kröner-Fresenius-Stiftung, la Fritz-Bender-Stiftung, la maladie de Crohn allemand et Colitis Foundation (DCCV), la clinique recherche groupe CEDER du Conseil allemand de la recherche (DFG), le programme de rubrique DFG microbiote, l’Initiative de champ émergeant et le DFG Collaborative Research Centers 643, 796 et 1181.

Materials

48-Well plate Sarstedt 833,923
Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2
Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA
Bovine Serum albumin (BSA) Applichem A1391,0100
CaCl2 Merck 2382
Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length CM Scientific 3520-050
CCL-2, human Immunotools 11343384
CD4-Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-045-101
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit ThermoFischer Scientific C34554
Centrifuge (Rotixa 50 RS) Hettrich
Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES
Confocal Microscope (TCS SP8) Leica
CXCL-10, human Immunotools 11343884
Dextran 500 Roth 9219.3
EDTA KE/9 ml Monovette Sarstedt
Falcons (50 mL) Sarstedt 62,547,004
Fc chimera isotype control R&D Systems 110-HG
Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) Baoding Shenchen Precision Pump Company
HEPES VWR J848-100ML
Human IgG Isotype Control ThermoFischer Scientific 31154
Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera R&D Systems 720-IC-050
LS-Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MgCl2 Roth
MnCl2 Roth
mouse IgG isotype control Miltenyi Biotec 130-106-545
Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera R&D Systems 6056-MC
NaCl Roth 3957.3
Natalizumab Biogen
Neubauer Counting chamber Roth T729.1
Pancoll, human PAN Biotech P04-601000
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Biochrom L 182-10 w/o Mg and Ca
Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) VWR 52858-000
purified anti-human CD18 Biolegend 302102
RPMI Medium 1640 Gibco Life Technologies 61870-010
Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length Ismatec SC0059
Serological Pipetts Sarstedt 861,254,025
Trypan blue Roth CN76.1
Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera Biolegend 553706
Vedolizumab (Entyvio) Takeda

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Becker, E., Schramm, S., Binder, M., Allner, C., Wiendl, M., Neufert, C., Atreya, I., Neurath, M., Zundler, S. Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease. J. Vis. Exp. (139), e58210, doi:10.3791/58210 (2018).

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