भेदभाव, रखरखाव, और मानव रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं का विश्लेषण: एक रोग BEST1 उत्परिवर्तनों के लिए एक डिश मॉडल में
Summary
यहाँ हम मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं असर रोगी-प्राप्त उत्परिवर्तनों से रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं अंतर करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद. उत्परिवर्ती सेल लाइनों immunoblotting, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और पैच दबाना सहित कार्यात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस रोग में एक डिश दृष्टिकोण देशी मानव RPE कोशिकाओं को प्राप्त करने की कठिनाई को दरकिनार ।
Abstract
हालांकि मानव BEST1 जीन में २०० से अधिक आनुवंशिक उत्परिवर्तनों की पहचान की गई है और रेटिना अपक्षयी रोगों से जुड़ा हुआ है, रोग तंत्र मुख्य रूप से BEST1 अध्ययन के लिए vivo मॉडल में एक अच्छा की कमी के कारण मायावी रह और शारीरिक स्थितियों के तहत अपने उत्परिवर्तनों । BEST1 encodes एक आयन चैनल, अर्थात् BESTROPHIN1 (BEST1), जो रेटिना वर्णक उपकला (RPE) में कार्य करता है; हालांकि, देशी मानव RPE कोशिकाओं के लिए अत्यंत सीमित पहुंच वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक बड़ी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे मानव RPEs असर BEST1 रोग उत्पंन करने के लिए-मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) से प्रेरित भेदभाव के कारण उत्परिवर्तनों । के रूप में hPSCs आत्म अक्षय हैं, इस दृष्टिकोण शोधकर्ताओं hPSC के एक स्थिर स्रोत के लिए विभिंन प्रायोगिक विश्लेषण के लिए RPEs, जैसे immunoblotting, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और पैच दबाना है, और इस तरह एक बहुत शक्तिशाली रोग प्रदान करता है के लिए अनुमति देता है एक डिश के लिए मॉडल BEST1-जुड़े रेटिना की स्थिति । विशेष रूप से, इस रणनीति RPE (पैथो) फिजियोलॉजी और ब्याज के अंय जीन natively RPE में व्यक्त अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
यह प्रलेखित किया गया है कि BEST1 जीन1,2,3,4,5,6 में आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के कारण कम से कम पांच रेटिना अपक्षयी रोग हैं , 7 , 8, पहले से ही २०० से अधिक की सूचना उत्परिवर्तनों की संख्या के साथ और अभी भी बढ़ रही है । इन BEST1-जुड़े रोगों, भी bestrophinopathies के रूप में जाना जाता है, प्रगतिशील दृष्टि हानि और भी अंधापन का कारण है, और वहां वर्तमान में कोई प्रभावी उपचार कर रहे हैं । BEST1के प्रोटीन उत्पाद अर्थात् BESTROPHIN1 (BEST1), एक Ca2 +-सक्रिय सीएल चैनल (CaCC ) विशेष रूप से रेटिना वर्णक उपकला में व्यक्त (RPE) आंखों की5,6, 8,9. महत्वपूर्ण बात, BEST1-जुड़े रोगों के एक नैदानिक phenotype प्रकाश उत्तेजनाओं के लिए कम दृश्य प्रतिक्रिया है, प्रकाश चोटी (एल. पी.) कहा जाता है electrooculogram में मापा10,11; एल. पी. RPE12,13,14में एक CaCC द्वारा मध्यस्थता माना जाता है. आदेश में बेहतर BEST1 उत्परिवर्तनों के रोग तंत्र को समझने के लिए और संभावित चिकित्सा के लिए काम करने के लिए, यह उत्परिवर्ती BEST1 चैनल endogenously मानव RPE कोशिकाओं में व्यक्त अध्ययन करने के लिए आवश्यक है ।
हालांकि, सीधे जीवित रोगियों से RPE कोशिकाओं को प्राप्त करने के अत्यधिक अव्यावहारिक है । यद्यपि देशी RPE कोशिकाओं को मानव cadavers और भ्रूणों के बायोप्सी से काटा जा सकता है, इन स्रोतों के लिए कठिन पहुँच वैज्ञानिक अनुसंधान को काफी सीमित करता है. इसलिए, यह वैकल्पिक RPE मानव आंखों के अलावा अंय स्रोतों के लिए महत्वपूर्ण है । इस कॉल को स्टेम सेल तकनीक में हाल ही में प्रगति के द्वारा उत्तर दिया गया है, कार्यात्मक RPE कोशिकाओं के रूप में अब मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से विभेदित किया जा सकता है (hPSCs), भ्रूण स्टेम सेल सहित (hESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs), बाद 16,17,18दानदाताओं से प्राथमिक त्वचा fibroblasts reprogramminging द्वारा उत्पंन किया जा रहा है । महत्वपूर्ण बात, स्व-नवीकरण और hPSCs के pluripotency RPEs उत्पन्न करने के लिए एक विश्वसनीय स्रोत सुनिश्चित करते हैं, जबकि जीनोमिक की hiPSCs और hESCs संशोधन क्षमता के रोगी-विशिष्टता (जैसे, CRISPR द्वारा) एक बहुमुखी रोग के लिए एक डिश मॉडल की पेशकश इि BEST1 उत्परिवर्तन ।
hPSC-RPE चूहों RPE मॉडल पर कई फायदे हैं: 1) BEST1 नॉकआउट चूहों किसी भी रेटिना विषमता19प्रदर्शित नहीं करते हैं, चूहों और मनुष्यों के बीच BEST1 में RPE के विभिन्न आनुवंशिक आवश्यकता की संभावना स्थापना; 2) मानव RPE कोशिकाओं के केवल 3% binucleate हैं, चूहों में ३५% के विपरीत20; 3) hiPSC-RPE potentiates रेटिना विकारों के नैदानिक उपचार में ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण21. फिर भी, पशु मॉडल एक जीवित प्रणाली में RPE फिजियोलॉजी और विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए अभी तक अपरिहार्य हैं, और hiPSC की oncogenic क्षमता की अनदेखी नहीं की जा सकती ।
प्रक्रिया यहां RPE भेदभाव प्रोटोकॉल है कि अनुसंधान और नैदानिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक उपयोगी और मामूली सरल hPSC का वर्णन । इस प्रोटोकॉल nicotinamide (विटामिन B3) का उपयोग करता है तंत्रिका ऊतक, जो आगे activin के साथ उपचार द्वारा RPE में अंतर करने के लिए प्रेरित है के लिए hPSCs के भेदभाव को बढ़ाने के लिए । Nicotinamide उपचार pigmented कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए दिखाया गया है (RPE में भेदभाव का संकेत), संभवतः22कोशिकाओं अंतर की अपोप्तोटिक गतिविधि क्षीणन द्वारा. परिणामी hPSC-RPE कक्ष समान कुंजी मार्करों, cobblestone आकृति विज्ञान और सेलुलर कार्यक्षमता मूल मानव RPE कोशिकाओं22के रूप में प्रदर्शित करें । इस प्रकार, एक अनुसंधान की स्थापना में, जिसके परिणामस्वरूप hPSC-RPE कोशिकाओं immunoblotting, immunostaining सहित बहाव कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं, और पूरे सेल पैच दबाना, जिसके लिए विस्तृत प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं भी प्रदान की जाती हैं । नैदानिक, RPE कोशिकाओं स्टेम सेल से व्युत्पंन दोनों पशु अध्ययन और मानव परीक्षण23में धब्बेदार अध-पतन के प्रत्यारोपण उपचार के लिए महान क्षमता दिखाया गया है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
रोग के लिए सबसे महत्वपूर्ण प्रक्रिया में एक डिश दृष्टिकोण एक रोग के साथ hPSCs अंतर करने के लिए सही कोशिका वंश है, जो BEST1के लिए RPE है उत्परिवर्तन के कारण है । इस प्रकार, प्रत्येक भेदभाव प्रयोग के बाद, परिणाम?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना NIH अनुदान EY025290, GM127652 द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और रोचेस्टर शुरू की वित्त पोषण विश्वविद्यालय ।
Materials
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
Riferimenti
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