この記事では、自然の現場から採集した単細胞の抱合藻類種のクローンの文化の確立を示しています。
それは生理学、遺伝学、分類学、微生物学などの様々 なトピックの研究に使用する微細藻類の栄養系文化を確立することが欠かせません。したがって、クローンの文化を確立する技術を開発する非常に重要です。この記事では、抱合藻の栄養文化の確立を示しています。水試料は、フィールドから収集されます。その後、セルはガラス毛細管ピペット、メディアに配置され、クローン培養の生成に適した条件下で栽培を使用して分離されます。
(注文 Zygnematales) の藻類の活用、またとして知られている conjugatophytes、占める土地の植物1,2の即時の祖先の最も近い生活親戚として重要な系統位置です。藻類の確立されたクローン文化は、過去年にわたってさまざまな分類学、生理学、遺伝学的研究につながっています。自然のフィールドからの微生物の分離技術は、長い伝統3,4を持っています。近年、フローサイトメトリーを用いた技術はまたずっと自動分離は5を設立しました。クローン培養の確立のための単一のセルを取得するために使用する最も一般的な方法は、ガラス毛細管ピペット6を使用して単一細胞分離です。この従来の方法では、スキルと正確な実験的プロトコルを必要があります。
この記事で示す藻類のサンプリング フィールド サンプルとミカヅキモ種などの単細胞接合藻類の栄養文化の確立からガラス毛細管ピペットを使用して.栄養細胞を含む水試料は、(例えば湖、池、または水田) 現場から収集されます。セルをガラス毛細管ピペットを用いて試料水から分離して洗浄し。16 h 光: 8 の下の 24 の ° C で窒素添加培地 (CA 中) を含む試験管に培養される細胞-h の暗い政権。このメソッドもクローン文化を生成する他の微細藻類を分離するのに最適です。
現在のメソッドを使用して、ミカヅキモsp 9 クローン培養株は 60% の成功率を表す水のサンプル (Inba1) から分離された 15 のセルから確立されました。種の同定は、形態学的観察と分子系統解析8などの DNA 解析によって将来的に実施するでしょう。
提案の方法では、試料水の鮮度は成功率に重要です。フィールド コレクション後できるだけ早く水サンプルから細胞を分離することをお勧めします。細胞の分離が望ましいが、ミカヅキモ属 (例えば c. ehrenbergii c. 学位論文紹介複雑な) セルは 4-8 ° C で保存することによって約 7 d のサンプルを水で維持できる、コレクションまたは次の日の日。また、洗濯の繰り返しの数を増やすので、標的細胞以外の任意の汚染物質を除去することが重要だ (すなわち、> 3 x) 細胞と土壌微生物による文化の汚染を防ぐことができます。
この技法の制限は、このプロトコル (CA または CA の馴化培地) で使用される文化メディア、必ずしもすべて接合藻類の適切です。いくつかのケースでは、他の媒体と同様、異なる光および温度条件の使用を検討する必要があります。また、文化が 1 つのセルから成長しているかどうかを証明することは困難は、テスト チューブにセルを転送するときだけ 1 つのセルを正確に選択する必要が。したがって、転送すべき新しいガラス毛細管ピペットでそれぞれの時間。
このピペット洗浄法とクローン培養を確立するクラシック/標準の方法を研究に必要な細胞を分離に使用する最も信頼性の高い方法です。多く研究8,9,,1011で使用される藻類の活用のクローンの文化は、現在のメソッドを使用して確立されました。クローン培養せず接合藻類を分析することは困難です。また、近年、 de novo全ゲノム シーケンス (例えば、ミニオン ナノポア sequencer を使用して) 取得、やすくなった、 de novoシーケンスがより一層高まるクローン文化を確立します。つまり、このメソッドは、最初のステップは、将来的にこれらの藻類の生物多様性を理解するための研究です。
安定した培養株を確立するためにプロトコル内で正確に特定の重要な手順を実行する必要は。1 つのセルのみの通過を許可する最適な絞り値とガラス毛細管ピペットの準備の最も重要なステップです。ガラス毛細管ピペットの絞りは興味のセルの短軸長さよりわずかに多くである必要があります。最適なガラス毛細管ピペットは、毛管作用によって単一のセルを吸引できます。ただし、開口部の直径が大きすぎる場合、毛細血管は非生活汚染物質材料やも (、) 他嫌気、ターゲット セルに加えて描画もできます。
最適な絞りとガラス毛細管ピペットを得るためには、次の点が注意してください。まず、ガラス毛細管ピペットを加熱するとき、炎の柱が細い必要があります。次に、パスツール ピペットを引っ張って、それは炎; から削除するがそうでなければ、パスツール ピペットの絞りが崩壊します。
機器とこのプロトコルに示すように容器の基本的な変更することができます。たとえば、1 つも時計メガネではなくウェル プレートを使用して、セル洗浄可能より効率的です。さらに、他の類似のものコンテナーを置き換えることが。最後のステップで培養液中に単一のセルを転送する、クローン培養を確立できます。
滅菌コンテナーを準備し、フードでの作業は無菌 (汚染) 系統を確立します。汚染を防ぐためには、3 倍以上の新しい因数洗浄手順を繰り返す必要は。場合によっては、抗生物質15を追加することによって細菌を殺菌することも。
このメソッドは当ててチリモ (Zygnematales) 分離がガラス毛細管ピペット開口部の大きさを変更すると、それは、異なるサイズのプランクトンの分離に適用できます。
野崎久 (東京大学)、仲田崇志 (慶應義塾大学)、由香丸川橋本 (日本女子大学)、関本浩之 (日本女子大学) を感謝いたします。我々 は彼らのコメントの校閲者を感謝したいと思います。本研究はあった科学研究 (号 26440223 ・ 15 H 04413) 日本学術振興会科研費により結城 Tsuchikane に新技術開発財団からの助成金でサポートされています。
Sampling | |||
Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
Preparation of a micropipette | |||
Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
Single-cell isolation | |||
Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |