Tek hücreli alg Conjugating klonal bir kültür kurulması
Summary
Bu makalede, biz klonal bir doğal alanı sitesinden toplanan tek hücreli conjugating yosun türlerin kültürleri kurulması göstermek.
Abstract
Mikroalg kullanmak için klonal kültürleri fizyolojisi, genetik, Taksonomi ve Mikrobiyoloji gibi çeşitli konularda çalışmaları kurmak için önemlidir. Böylece, klonal kültürler kurmak için teknikleri geliştirmek son derece önemlidir. Bu makalede, biz conjugating alga klonal kültürleri kurulması göstermek. Su örnekleri tarladan toplanır. Daha sonra medyada yer ve klonal bir kültür oluşturmak için uygun koşullar altında yetiştirilen bir cam kapiller pipet, kullanarak izole hücrelerdir.
Introduction
Algler (Zygnematales düzenin) conjugating, olarak da bilinen conjugatophytes, işgal arazi bitkiler1,2hemen atalarının en yakın yaşayan akrabası olarak anahtar bir filogenetik konumu. Klonal kültürleri oluşturulmuş: yosun taksonomik, fizyolojik ve genetik çalışmalar çok çeşitli için son yıl içinde açmıştır. Doğal bir alandan mikroorganizmaların yalıtım teknikleri uzun geleneği3,4var. Son yıllarda, otomatik yalıtım teknikleri kullanarak akış sitometresi de5kurdu. Klonal bir kültür kurulması için tek bir hücre elde etmek için kullanılan en yaygın yöntemdir cam kapiller pipet6kullanarak tek hücreli yalıtım. Bu geleneksel yöntem beceri ve hassas bir deneysel protokol gerektirir.
Bu makalede, biz yosun örnekleme alanı örnekleri ve Closterium türler gibi conjugating tek hücreli alg klonal kültürler kurulması bir cam kapiller pipet kullanarak göstermek. Bitkisel hücreleri içeren su örneği bir alan sitesinden (Örneğin, bir göl, gölet veya çeltik alan) toplanır. Hücreler bir cam kapiller pipet kullanarak su örneği izole ve sonra yıkanır. Hücreleri azot takıma Orta (CA orta) içeren bir test tüpünde bir 16-h ışık: 8 altında 24 ° C’de kültürlü-s karanlık rejimi. Bu yöntem klonal kültürler oluşturmak için diğer mikroalg yalıtmak için uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut yöntemini kullanarak, Closterium sp. 9 klonal kültür suşları %60 başarı oranı temsil eden su örneği (Inba1), izole 15 hücrelerden kuruldu. Tür kimliği gelecekte morfolojik gözlem yanı sıra moleküler filogenetik Analizi8gibi DNA analizleri yapılacaktır.
Mevcut yönteminde su örneği tazelik için başarı oranı önemlidir. Su örnekleri hücrelerden en kısa zamanda alan koleksiyonu sonra ayırmak daha iyidir. Her ne kadar Closterium türlerinin (Örneğin, C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum-littorale karmaşık) hücreleri su örnek için 7 d 4-8 ° C’de depolayarak korunabilir, yalıtım hücrelerin arzu edilir Rezervasyonun yapıldığı gün toplama ya da öbür gün. Yani çamaşır Tekrarlamaların sayısını artırmayı hedef hücreleri dışında herhangi bir kirletici kaldırmak önemlidir (Örneğin, > 3 x) kültürlerin bir kirlenme mikroorganizmaların toprak ve hücreleri tarafından engel olabilir.
Bu tekniğin bir sınırlama kültür bu protokol (CA veya şartına CA orta) için kullanılan ortam her zaman tüm conjugating algler için uygun değildir. Bazı durumlarda, başka bir ortam, aynı zamanda farklı ışık ve sıcaklık koşullarında kullanmayı düşünün gerekebilir. Ayrıca, bu bir kültür bir tek hücreden büyüdü olup olmadığını kanıtlaması zor olduğundan, doğru bir şekilde sadece 1 hücre hücreleri bir test tüpünde aktarırken almak gereklidir. Bu nedenle, Transfer bir yeni cam kapiller pipet ile her zaman yapılmalıdır.
Klonal bir kültür yöntemi yıkama Bu pipet ile kurulması bir klasik/standart yöntemdir ve bir çalışma için istediğiniz hücreleri izole etmek için kullanmak için en güvenilir yöntemdir. Birçok çalışmalar8,9,10,11 kullanılan yosun conjugating klonal kültürleri mevcut yöntemini kullanarak kuruldu. Conjugating yosun klonal bir kültür olmadan analiz etmek zordur. Ayrıca, son yıllarda de novo tüm genom dizileri (MinION nanopore sequencer kullanarakÖrneğin,) elde etmek kolay oldu ve klonal kültürler oluşturma de novo sıralama daha da kolaylaştıracaktır. Başka bir deyişle, bu yöntem ilk adım gelecekte onların biyolojik çeşitliliğin daha iyi anlamak için bu alg eğitim olur.
Bir kararlı kültür yük oluşturmak için doğru protokolü içinde kritik belirli adımları gerçekleştirmek gereklidir. Sadece tek bir hücreye geçişini izin vermek için en uygun bir diyafram ile cam kapiller pipet hazırlanması en önemli adımdır. Cam kapiller pipet diyafram faiz hücre küçük eksen uzunluğundan daha biraz daha fazla olması gerekir. Optimum cam kapiller pipet tek bir hücre kılcal eylem tarafından Aspire. Ancak, diyafram çapı çok büyükse, kılcal da olmayan yaşam kirletici maddeler veya bile (bir) diğer organism(s), hedef hücre ek olarak çizecektir.
Bir cam kapiller pipet optimum bir diyafram ile elde etmek için aşağıdaki noktaları unutmayın. İlk olarak, alev ayağı cam kapiller pipet Isıtma dar olması gerekir. Ardından, Pasteur pipet çekerek zaman o alev kaldırılması gerekir; Aksi takdirde, Pasteur pipet diyafram çökecek.
Ekipman ve kapsayıcılar bu protokol için gösterilen temel ve değiştirilebilir. Örneğin, çok iyi plakaları izle gözlük bir kuyu ile yerine kullanarak, hücre çamaşır daha verimli hale getirilebilir. Buna ek olarak, konteyner benzer diğerleri için yedek olabilir. Tek bir hücre kültür ortamına son aşamada aktararak, klonal bir kültür kurulabilir.
Steril bir kap hazırlama ve bir mahallede çalışma axenic (kirlenmemiş) suşlar kuracak. Kontaminasyonu önlemek için daha–dan 3 x ile taze aliquots çamaşır adımı yinelemek gereklidir. Bazen bakteriler de antibiyotik15ekleyerek sterilize.
Bu yöntem desmid üzerinde (Zygnematales) yalıtım odaklı, ancak cam kapiller pipet diyafram boyutunu değiştirerek, bu farklı ölçekli plankton yalıtım için uygulanabilir.
Acknowledgements
Biz Hisayoshi Nozaki (Tokyo Üniversitesi), Takashi Nakada (Keio Üniversitesi), Yuka Marukawa Hashimoto (Japonya Kadın Üniversitesi) ve Hiroyuki Sekimoto (Japonya Kadın Üniversitesi) teşekkür ederim. Gözden geçirenler kendi yorum için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada bilim promosyon, Japonya, Japonya toplumdan bilimsel araştırma (No. 26440223 ve 15 H 04413) için bir Grant-in-Aid ve yeni teknoloji geliştirme Vakfı Hibe Yuki Tsuchikane için tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
Riferimenti
- Wickett, N. J., et al. Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).
- Delwiche, C. F., Cooper, E. D. The evolutionary origin of a terrestrial flora. Current Biology. 25, R899-R910 (2015).
- Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms. British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).
- Pringsheim, E. G. . Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , 119 (1946).
- Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N., Andersen, R. A. Automated isolation techniques for microalgae. Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. , 101-116 (2005).
- Andersen, R. A., Kawachi, M., Andersen, R. A. Traditional microalgae isolation techniques. Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. , 83-100 (2005).
- Abe, J., et al. Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).
- Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta). Phycological Research. 59, 74-82 (2011).
- Kanda, N., et al. CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Scientific Reports. 7, 17873 (2017).
- Ichimura, T. Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini. Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).
- Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Planta. 182, 348-354 (1990).
- Ichimura, T., Watanabe, M. The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems. Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).
- Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , 84-96 (1960).
- Provasoli, L., Tryon, C. A., Hartmann, R. T. Media & prospects for the cultivation of marine algae. Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. , 63-75 (1968).
- Guillard, R. R. L., Andersen, R. A. Purification methods for microalgae. Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. , 117-132 (2005).
