إنشاء ثقافة الاستنساخ من الطحالب التصريف أحادي الخلية
Summary
في هذه المقالة، نبدي إنشاء ثقافات الاستنساخ من أنواع الطحالب التصريف أحادي الخلية التي تم جمعها من موقع حقل طبيعية.
Abstract
من الضروري إنشاء ثقافات الاستنساخ من الطحالب المجهرية لاستخدامها في الدراسات المتعلقة بمختلف المواضيع، مثل علم وظائف الأعضاء وعلم الوراثة، والتصنيف وعلم الأحياء المجهرية. وهكذا، أنها بالغة الأهمية لتطوير تقنيات إنشاء ثقافات الاستنساخ. في هذه المقالة، نبدي إنشاء ثقافات الاستنساخ طحلب التصريف. يتم جمع عينات المياه من الحقل. وفي وقت لاحق، خلايا معزولة زجاج ماصة شعرية، وضعت في وسائط الإعلام، ونمت تحت ظروف مناسبة لتوليد ثقافة الاستنساخ باستخدام.
Introduction
التصريف الطحالب (للنظام زيجنيماتاليس)، تعرف أيضا باسم كونجوجاتوفيتيس، تشغل موقعا النشوء والتطور رئيسية كأقرب الأقارب الذين يعيشون من أسلاف الفوري من الأراضي النباتات1،2. الثقافات الاستنساخ المتبعة من الطحالب أدت إلى طائفة واسعة من الدراسات التصنيفية والفسيولوجية والجينية على مدى السنوات الماضية. تقنيات عزل الكائنات الدقيقة من حقل طبيعية لها تقاليد عريقة في3،4. في السنوات الأخيرة، أنشأت العزل الآلي تقنيات استخدام التدفق الخلوي كما كانت5. الطريقة الأكثر شيوعاً المستخدمة للحصول على خلية واحدة لإنشاء ثقافة الاستنساخ عزل الخلايا المفردة باستخدام ماصة شعرية زجاج6. يتطلب هذا الأسلوب التقليدي المهارة وبروتوكول تجريبي دقيق.
في هذه المقالة، نبدي أخذ عينات الطحالب من عينات ميدانية وإنشاء ثقافات الاستنساخ من الطحالب التصريف أحادي الخلية، مثل الأنواع كلوستيريوم ، استخدام ماصة شعرية زجاج. يتم جمع عينة مياه التي تحتوي على الخلايا النباتية من موقع حقل (مثلاً، بحيرة، بركة، أو حقول الأرز). الخلايا المعزولة من عينات المياه باستخدام ماصة شعرية زجاج وثم غسلها. هي الخلايا المستزرعة في أنبوب اختبار يحتوي على تكملة النيتروجين المتوسطة (CA المتوسطة) في 24 درجة مئوية تحت ضوء: 8 16-ح-ح نظام الظلام. هذا الأسلوب أيضا مناسبة لعزل الطحالب المجهرية الأخرى لتوليد الثقافات الاستنساخ.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام هذا الأسلوب، تم إنشاء ثقافة الاستنساخ 9 سلالات كلوستيريوم sp. من 15 الخلايا المعزولة من عينة المياه (Inba1)، الذي يمثل نسبة نجاح 60%. تحديد الأنواع ستنفذ في المستقبل بالملاحظة المورفولوجية، فضلا عن إجراء تحاليل الحمض النووي، مثل تحليل النشوء والتطور الجزيئي8.
في هذا الأسلوب، المهم نضارة عينة المياه معدل النجاح. فمن الأفضل لعزل الخلايا من عينات المياه وقت ممكن بعد الجمع الميداني. على الرغم من أن يمكن الحفاظ على خلايا الأنواع كلوستيريوم (مثلاً، اهرينبيرجي جيم، جيم-بيراسيروسوم-ستريجوسوم-littorale المعقدة) في عينة المياه لحوالي 7 د بتخزينها في 4-8 درجة مئوية، عزل الخلايا أمر مرغوب فيه في اليوم لجمع أو في اليوم التالي. من المهم أيضا لإزالة أي ملوثات عدا الخلايا الهدف، لذلك زيادة عدد التكرار الغسل (أي، > 3 x) قد منع تلوث من الثقافات بالكائنات الدقيقة في التربة وخلايا.
وجود قيود على هذا الأسلوب أن ثقافة الوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول (CA أو مكيفة CA المتوسطة) ليست دائماً مناسبة لجميع الطحالب التصريف. في بعض الحالات، قد يكون من الضروري النظر في استخدام أية وسيلة أخرى، فضلا عن ضوء مختلف وظروف الحرارة. أيضا، كما أنه يصعب إثبات ما إذا كانت ثقافة نمت من خلية واحدة، من الضروري أن دقة انتقاء الخلية 1 فقط عند نقل الخلايا إلى أنبوب اختبار. ولذلك نقل ينبغي أن يتم مع ماصة شعرية جديدة زجاج في كل مرة.
إرساء ثقافة الاستنساخ مع ماصة هذا الغسيل الأسلوب هو أسلوب الكلاسيكية/قياسي وهو الأسلوب الأكثر موثوقية لاستخدام لعزل الخلايا المطلوبة لدراسة. تم إنشاء ثقافات الاستنساخ التصريف الطحالب المستخدمة في العديد من الدراسات8،،،من910،11 باستخدام هذا الأسلوب. من الصعب تحليل الطحالب التصريف دون ثقافة الاستنساخ. وعلاوة على ذلك، في السنوات الأخيرة، تسلسل الجينوم كله حيثياته أصبح من السهل الحصول على (مثلاً، باستخدام جهاز التسلسل نانوبوري العميل)، وإنشاء ثقافات الاستنساخ سيزيد من تسهيل تسلسل حيثياته . وبعبارة أخرى، أن هذا الأسلوب الخطوة الأولى في المستقبل دراسة لهذه الطحالب فهم أفضل للتنوع البيولوجي.
من أجل إقامة سلالة ثقافة مستقرة، من الضروري القيام ببعض الخطوات الحاسمة بدقة ضمن البروتوكول. أهم خطوة هي إعداد ماصة الشعرية الزجاج مع فتحه أمثل للسماح بمرور من خلية مفردة فقط. يجب أن تكون فتحه الماصة الشعرية الزجاج أكثر قليلاً من طول المحور طفيفة الخلية للفائدة. يمكن نضح الماصة الشعرية الزجاج الأمثل خلية واحدة بعمل شعري. إذا كانت قطر الفتحة كبيرة جداً، بيد سوف أيضا رسم شعري في المواد غير الحية الملوث أو حتى (an) أخرى organism(s)، بالإضافة إلى الخلية الهدف.
للحصول على زجاج ماصة شعرية مع فتحه أمثل، النقاط التالية من المهم ملاحظة. أولاً، يجب أن تكون الدعامة للهب ضيقة عند تدفئة الماصة الشعرية الزجاج. بعد ذلك، عندما سحب ماصة باستور، لديها المراد إزالتها من اللهب؛ وإلا فسوف تنهار فتحه ماصة باستور.
المعدات وحاويات المبينة في هذا البروتوكول هي الأساسية ويمكن تعديلها. على سبيل المثال، باستخدام لوحات متعددة جيدا بدلاً من مشاهدة النظارات مع بئر واحدة، الغسيل خلية يمكن إجراء أكثر كفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون بديلاً الحاويات لمماثلة أخرى. بنقل خلية واحدة إلى المتوسطة الثقافة في الخطوة الأخيرة، يمكن تأسيس ثقافة الاستنساخ.
وستنشئ إعداد حاوية معقمة والعمل في غطاء سلالات (غير ملوثة) أكسينيك. لمنع التلوث، من الضروري تكرار الخطوة الغسيل مع مختبرين الطازجة أكثر من 3 س. في بعض الأحيان، كما يجري تعقيم البكتيريا بإضافة15من المضادات الحيوية.
يركز هذا الأسلوب على ديسميد العزلة (زيجنيماتاليس)، ولكن عن طريق تغيير حجم الفتحة الشعرية الماصة الزجاجية، ويمكن تطبيقها لعزل العوالق الحجم بشكل مختلف.
Acknowledgements
ونشكر هيسايوشي نوزاكي (جامعة طوكيو)، تاكاشي ناكادا (جامعة كيو)، يوكا ماروكاوا هاشيموتو (جامعة “المرأة” في اليابان)، وهيرويوكي سيكيموتو (جامعة “المرأة” في اليابان). نود أن نشكر المراجعين لإبداء تعليقاتها عليها. كان يؤيد هذه الدراسة معونات “البحث العلمي” (رقم 26440223 و 15 ح 04413) من “الجمعية اليابانية” “تعزيز العلوم”، اليابان، ومنحة من “مؤسسة تنمية التكنولوجيا الجديدة” إلى يوكي تسوتشيكاني.
Materials
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
Riferimenti
- Wickett, N. J., et al. Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).
- Delwiche, C. F., Cooper, E. D. The evolutionary origin of a terrestrial flora. Current Biology. 25, R899-R910 (2015).
- Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms. British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).
- Pringsheim, E. G. . Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , 119 (1946).
- Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N., Andersen, R. A. Automated isolation techniques for microalgae. Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. , 101-116 (2005).
- Andersen, R. A., Kawachi, M., Andersen, R. A. Traditional microalgae isolation techniques. Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. , 83-100 (2005).
- Abe, J., et al. Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).
- Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta). Phycological Research. 59, 74-82 (2011).
- Kanda, N., et al. CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Scientific Reports. 7, 17873 (2017).
- Ichimura, T. Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini. Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).
- Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Planta. 182, 348-354 (1990).
- Ichimura, T., Watanabe, M. The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems. Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).
- Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , 84-96 (1960).
- Provasoli, L., Tryon, C. A., Hartmann, R. T. Media & prospects for the cultivation of marine algae. Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. , 63-75 (1968).
- Guillard, R. R. L., Andersen, R. A. Purification methods for microalgae. Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. , 117-132 (2005).
