Summary

Profunda dérmica injeção como um modelo de Candida albicans de infecção da pele para análise histológica

Published: June 13, 2018
doi:

Summary

Aqui descrevemos um protocolo que permite a análise histológica e molecular de amostras de pele após injeção intradérmica de Candida albicans . Esse protocolo mantém a integridade estrutural da pele e permite a localização do tecido-residente ou recém recrutadas células do sistema imunológico, bem como a distribuição do patógeno.

Abstract

A pele é um órgão extremamente estendido do corpo e, devido a esta grande superfície, é continuamente exposto a microorganismos. Danos de pele podem facilmente levar a infecções na derme, que por sua vez, pode, resultar na disseminação de patógenos para a corrente sanguínea. Compreender como o sistema imunológico combate infecções na fase inicial e como o host pode eliminar os patógenos, é um passo importante para definir a base para futuras intervenções terapêuticas. Aqui descrevemos um modelo de infecção por Candida albicans que pode visualizar os processos que ocorrem durante uma infecção, incluindo quando o patógeno já passou a barreira epitelial, bem como a resposta imune provocada pela de c. albicans invasão. Usamos este modelo de infecção para realizar análises histológicas que mostram as células imunitárias que se infiltrar a pele, bem como a presença e a localização do patógeno. As amostras coletadas após a infecção pode ser processada para extração de RNA.

Introduction

O corpo humano é coberto com um número extremamente elevado de microorganismos. A superfície da pele é o habitat de quase 1 milhão de bactérias por centímetro quadrado1. Este número, no entanto, não reflete a completa variedade de microorganismos que coloniza a pele. Além de bactérias, o corpo humano é colonizado por muitas espécies de fungos, incluindo c. albicans, que é capaz de sobreviver tanto as mucosas e a pele de nível2.

Nos últimos anos, a percentagem de pessoas diagnosticadas com infecções fúngicas aumentou enormemente. Isto é principalmente devido ao maior número de pessoas imunodeprimidas, ou seja, pacientes HIV-positivos e pacientes que passaram por quimioterapia ou drogas imunossupressoras após transplante3. Em um estudo de vigilância realizado nos Estados Unidos, Wisplinghoff et al mostrou que 9,5% das infecções nosocomiais corrente sanguínea foram causadas por espécies de Candida 4. Devido à maior ocorrência de infecções fúngicas e especialmente devido à elevada percentagem de Candida espécies encontradas durante infecções na corrente sanguínea, compreender como este patógeno escapa do controle do sistema imunológico é extremamente importante.

C. albicans é um fungo dimórfico que cresce em diferentes formas morfológicas tais como levedura, vermiforme, pseudo-hifas e hifas consoante as condições ambientais5. Na sua forma hifal, c. albicans mostra sua mais alta capacidade de invasividade e tem a capacidade de penetrar o epitélio6.

C. albicans infecções têm sido estudadas usando várias abordagens experimentais. O modelo mais comum de infecção é a injeção intravenosa de c. albicans levedura7. No entanto, este modelo não leva em consideração todos os processos que acontecer antes que o fungo consegue espalhar-se para a corrente sanguínea. Outro modelo aproveita a capacidade de c. albicans para invadir o epitélio. Este método, também conhecido como, o papel da areia modelo8, foi desenvolvido por Gaspari et al . em 1998,9e consiste no uso de papel da areia para friccionar a pele, eliminando assim o estrato córneo antes de aplicar a c. albicans. Este procedimento permite que o fungo penetrar o epitélio, possibilitando assim a análise das habilidades invasivas deste patógeno. Finalmente, outros modelos de infecções para o gastrointestinal10 e respiratórias11 têm sido utilizados em diferentes estudos.

A formação de uma ferida (como no modelo de papel da areia) provoca a ativação de várias vias, incluindo o recrutamento de células imunes e ativação, a fim de promover a cura do processo12. Isto pode alterar ou mascarar a resposta imune suscitou especificamente contra o patógeno, conduzindo assim a confundir os resultados.

Aqui nós descrevemos um método de infecção da pele que evita a formação de ferida inicial e a indução de um ambiente inflamatório basal. Para manter a estrutura epitelial intacta, injetamos diretamente c. albicans em sua forma hifas no derma profunda. Mesmo que uma única injeção pode provocar inflamação suave, a quantidade de inflamação é limitada e restrito em comparação com a formação de uma ferida aberta, como no modelo de papel da areia. A abordagem que descrevemos aqui permite o estudo da resposta imune à infecção fúngica e disseminação, evitando o ambiente inflamatório pré-existente e excessivo causado por danos mecânicos.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados sob o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) e operados sob a supervisão do departamento de recursos animais às crianças do Hospital (ARCH) no Hospital infantil de Boston, ou foram aprovados pelo italiano Ministério da saúde e executada sob o Animal conta Comissão institucional da Universidade de Milano-Bicocca. 1. preparação de c. albicans Cultura C. albicans, estirpe CAF3-113, em…

Representative Results

Através da injecção de patógeno diretamente no derma profunda, a morfologia estrutural do tecido permanece intacta (figura 1A). A manutenção da integridade estrutural da pele permite a detecção de células do sistema imunológico e sua localização no local da infecção. A maior ampliação mostrada na figura 1B revela que o abscesso é composto principalmente…

Discussion

Aqui nós descrevemos um método de infecção de c. albicans para estudar o processo inflamatório que é iniciado após a entrada de fungosa no derma profunda.

Mesmo que a formação de abscesso da pele é um evento relativamente raro em cima de infecção de c. albicans 15, injeção do fungo diretamente no derma profunda permite não só o estudo da formação de abscesso orientada por fungos, mas também a análise de imune específica células qu…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

FG é suportado pela Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Fundação Cariplo (Grant 2014-0655) e Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB).
IZ é suportado pelo NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical escola Milton encontrou, CCFA Senior Research Awards (412708), a Eleanor e Miles Shore 50º aniversário Fellowship Program e a Fundação Cariplo ( 2014-0859).

Materials

Reagents
PBS Euroclone ECB4053L warm in 37 °C bath before use
H-OCT compound histo-line laboratories R0030
Gill's Hematoxilyn histo-line laboratories 09-178-2
Eosin Y solution, alcoholic histo-line laboratories 09-209-05
Ethanol absolute scharlau ET00232500
Citro-HISTOCLEAR histo-line laboratories R0050
Eukitt, mounting medium bio-optica
Acetone sigma-aldrich 179124
PAS staining system sigma-aldrich 395B-1KT
Bacto Peptone BD 211677
Bacto Yeast Extract BD 212750
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology Applichem PanReac 50-99-7
Uridine Merck Millipore 8451
HEPES Applichem PanReac A1070,0500
Safe-Lock tubes 2 mL eppendorf 30121597
TRIzol Reagent Life Technologies 15596018 Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed
Rneasy Mini Kit QIAGEN 74104
liquid nitrogen Wear eye protection
Instrument
Coulter Counter-Particle Count Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat histo-line laboratories
TissueLiser QIAGEN
Materials
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle  BD 324826
Surgical forceps
Surgical scissors
Base mould disposable histo-line laboratories 2781
Positively charged bio microscope slides bio-optica 09-2000
Cover slips 24 x 50 mm thermo scientific 11911998

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Santus, W., Mingozzi, F., Vai, M., Granucci, F., Zanoni, I. Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (136), e57574, doi:10.3791/57574 (2018).

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