Profonde cutanée Injection comme un modèle d’Infection de la peau de Candida albicans pour les Analyses histologiques
Summary
Nous décrivons ici un protocole qui permet l’analyse histologique et moléculaire des échantillons de peau après injection intradermique de Candida albicans . Ce protocole permet la localisation des cellules immunitaires tissulaires-résident ou nouvellement recrutés, mais aussi la distribution de l’agent pathogène et maintient l’intégrité structurale de la peau.
Abstract
La peau est un organe extrêmement étendu du corps et, en raison de cette grande surface, elle est exposée en permanence aux micro-organismes. Lésions cutanées peuvent facilement conduire à des infections dans le derme, ce qui peut, à son tour, entraîner la dissémination d’agents pathogènes dans la circulation sanguine. Comprendre comment le système immunitaire combat les infections au stade très précoce et comment l’hôte permet d’éliminer les agents pathogènes est une étape importante pour définir la base pour de futures interventions thérapeutiques. Nous décrivons ici un modèle d’infection de Candida albicans qui permet de visualiser les processus qui se produisent au début lors d’une infection, y compris lorsque l’agent pathogène a passé la barrière épithéliale, ainsi que la réponse immunitaire provoquée par le de c. albicans invasion. Nous avons utilisé ce modèle d’infection d’effectuer des analyses histologiques qui montrent les cellules immunitaires qui infiltrent la peau ainsi que la présence et la localisation de l’agent pathogène. Les échantillons prélevés après que l’infection peut être traitée pour l’extraction de l’ARN.
Introduction
Le corps humain est recouvert d’un nombre extrêmement élevé de micro-organismes. La surface de la peau est l’habitat de presque 1 million de bactéries par centimètre carré1. Sur ce nombre, cependant, ne reflète pas la grande variété de micro-organismes qui colonise la peau. En plus des bactéries, le corps humain est colonisé par plusieurs espèces de champignons dont c. albicans, qui est capable de survivre à la muqueuse et la peau niveau2.
Ces dernières années, le pourcentage de personnes atteintes d’infections fongiques a énormément augmenté. Ceci est principalement dû au nombre plus élevé de personnes immunodéprimées, c’est-à-dire, chez les patients VIH-positifs et les patients qui sont passés par une chimiothérapie ou immunosuppresseurs après transplantation3. Dans une étude de surveillance réalisée aux États-Unis, Wisplinghoff et coll. ont montré que 9,5 % des infections nosocomiales circulation sanguine ont été causés par les espèces de Candida 4. En raison de la présence accrue d’infections fongiques et notamment en raison du pourcentage élevé des espèces de Candida trouvés au cours de septicémies, comprendre comment ce pathogène échappe au contrôle du système immunitaire est extrêmement important.
C. albicans est un champignon dimorphique qui se développe sous différentes formes morphologiques comme levure, blastospores, pseudohyphes et les hyphes selon les conditions environnementales5. Dans sa forme mycélienne, c. albicans montre sa plus grande capacité de pouvoir envahissant et a la capacité de pénétrer l’ épithélium6.
C. albicans infections ont été étudiées à l’aide de plusieurs approches expérimentales. Le modèle le plus courant d’infection est l’injection intraveineuse de c. albicans levure7. Toutefois, ce modèle ne prend pas en considération tous les processus qui se produisent avant que le champignon parvient à se propager dans la circulation sanguine. Un autre modèle tire parti de la capacité de c. albicans à envahir l’épithélium. Cette méthode, également connu sous le nom le papier sablé modèle8, a été développée par Gaspari et al. , 1998,9et consiste à l’aide de papier sablé frotter sur la peau, ce qui élimine la couche cornée avant l’application de c. albicans. Cette procédure permet au champignon de pénétrer dans l’épithélium, permettant ainsi l’analyse des capacités invasives de cet agent pathogène. Enfin, les autres modèles des infections pour la gastro-intestinal10 et respiratoires,11 ont été utilisés dans différentes études.
La formation d’une plaie (comme dans le modèle de papier sablé) entraîne l’activation de plusieurs voies, y compris le recrutement de cellules immunitaires et d’activation, afin de favoriser la guérison des processus12. Cela peut altérer ou masquer la réponse immunitaire provoquée spécifiquement contre l’agent pathogène, ce qui conduit à la confusion des résultats.
Nous décrivons ici une méthode d’infection de la peau qui évite la formation de la blessure initiale et l’induction d’un environnement inflammatoire basale. Pour maintenir la structure épithéliale intacte, on injecte directement c. albicans dans sa forme mycélienne dans le derme profond. Même si une seule injection peut déclencher l’inflammation bénigne, le montant de l’inflammation est limité et restreinte par rapport à la formation d’une plaie ouverte, comme dans le modèle de papier sablé. L’approche que nous décrivons ici permet l’étude de la réponse immunitaire à l’infection fongique et propagation tout en évitant l’environnement inflammatoire excessive et préexistant, causée par des lésions mécaniques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons décrit une méthode de l’infection à c. albicans pour étudier le processus inflammatoire qui est ouverte sur l’entrée fongique dans le derme profond.
Même si la formation d’abcès de peau est un événement relativement rare lors d’infection à c. albicans 15, injection du champignon directement dans le derme profond permet non seulement l’étude de la formation d’abcès axée sur les champignons, mais aussi l’analyse…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
FG est pris en charge par l’Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Fondation Cariplo (Grant 2014-0655) et Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB).
IZ est pris en charge par les NIH grant 1R01AI121066-01 a 1, 1R01DK115217, grant HDDC P30 DK034854, Harvard Medical School trouvé de Milton, CCFA Senior Research Awards (412708), l’Eleanor et le Miles rive 50e anniversaire du programme de bourses et la Fondation Cariplo ( 2014-0859).
Materials
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
Riferimenti
- Belkaid, Y., Segre, J. A. Dialogue between skin microbiota and immunity. Science. 346 (6212), 954-959 (2014).
- Kashem, S. W., Kaplan, D. H. Skin Immunity to Candida albicans. Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).
- Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. Epidemiological trends in skin mycoses worldwide. Mycoses. 51, 2-15 (2008).
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 4 (1), 11-24 (2004).
- Odds, F. C. Pathogenesis of Candida infections. J Am Acad Dermatol. 31 (3), S2-S5 (1994).
- MacCallum, D. M., Odds, F. C. Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice. Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).
- Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -. Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. Animal models of external traumatic wound infections. Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).
- Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections. Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Mear, J. B., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).
- Leoni, G., Neumann, P. -. A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. Wound repair: role of immune-epithelial interactions. Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).
- Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans. Genetica. 134 (3), 717-728 (1993).
- Santus, W., et al. Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems. Sci Immunol. 2 (15), (2017).
- Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient. Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).
- Pradeu, T., Cooper, E. L. The danger theory: 20 years later. Front Immunol. 3, 287 (2012).
- Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).
