このメソッドは、任意の二倍体のひずみから四倍体、三倍体線虫寄生線虫の生成できます。このメソッドによって生成される倍数体の系統は、減数分裂の前期では、染色体の相互作用の研究に使用されているし、このメソッドはセル、発達、進化、および癌生物学の重要な基本的な質問を調べる際に役立ちます。
全ゲノム倍数体を含む機構開発と進化に重要な役割を再生します。また、四倍体細胞の異常発生は両方の癌の進行と薬剤耐性の開発に関連付けられています。今までは、ほとんど無菌子孫を生成することがなく、多細胞動物の倍数性を簡単に操作することはなかった。四倍体線虫を生成するための簡単かつ迅速なプロトコルは、ここで提示された任意の二倍体のひずみからの動物。このメソッドでは、最終的にc. の elegansの倍数性を増加、減数分裂期の染色体分離のバイアスを作成することができます。この戦略は、二倍体の配偶子を生成するrec 8遺伝子の発現の一時的な減少に依存します。Rec 8変異体には、受精時に四倍体を作り出すことができる可能性のある二倍体の配偶子が生成されます。この扱いやすいスキームは、四倍体株の突然変異とのペアリングと減数分裂におけるシナプスの間に染色体の動態と相互作用への洞察力を得るために染色体の語順換えを運ぶを生成する使用されています。このメソッドは、遺伝マーカーなし安定した四倍体菌株を生成する効率的です、任意の二倍体のひずみに適用することができます、使用、三倍体のc. の elegansを派生できます。この直接的な方法はゲノムの不安定性、遺伝子量、生物学的スケーリング、細胞シグナル伝達、適応ストレス、薬剤への抵抗の開発に関連するその他の基本的な生物学的質問を調査するため役に立つと種分化の機構。
全ゲノム倍数体が自然界に存在する、適応、種分化、器官形成、創傷治癒および生物学的スケーリング; 必要なステップで多くの場合がんと薬1,2,3,4,5,6,7,8,への抵抗を促進するために知られているも9,10,11,12. 農業・水産業化学処理 (例えばコルヒチン、orzalin) より高速な成長率とかさばる作物と家畜13,を取得する倍数性植物、魚および貝を生成する14,15。四倍体の実験と非効率的な生産は、マウスやゼブラフィッシュ モデル システム16,17に存在します。ただし、生成されるほとんどまたはすべての倍数性の多細胞動物は強肩致死または生殖不能およびこうして多細胞の有機体の倍数性の影響に関する実験的研究には適していません。その結果、多細胞生物におけるゲノム polyploidization のいずれかを理解されている限られた密接に関連種に進化最近 polyploidization イベント18,19,20 から.生物学的役割のクエリまたは polyploidization の結果を事前にパス線虫モデル システムの使用であります。重要なは、線虫は通常、二倍体として存在するのみ 5 常染色体 (A) とゲノムあたり 1 つの性染色体 (X) が含まれている、生物学的過程の生体内観察用透明になりますが扱いやすい遺伝的システムと(性的に成熟した大人に卵) から 3-4 日の短いライフ サイクルがあります。線虫ゲノム自然に倍数性の最も一般的なタイプは、四倍体として再現できるように示されています。三倍体の動物は、二倍体と四倍体を交配することによって生成できます、その倍数性が不安定で、世代のカップル以内に二倍体系統になります。
最後の数十年でほんの一握り実行可能、肥沃な線虫の四倍体系統で分離された研究室は骨の折れるし系統21,22,限られた種類のみを生成する戦略を使用して23. この戦略はおそらく遺伝マーカーを用いた推定の倍数性動物のためのスクリーニングに続いて、配偶子の染色体分配に影響を与える熱ショック処理による線虫の四倍体を生成します。これらの四倍体は、この線虫が男性または両性具有になるかどうかを決定する方法のお問い合わせに非常に有益だった。その後の研究は、成長、遺伝子量とこの線虫21,24,25,26の減数分裂期にシナプスの規制を検討するのに利用可能な系統を使用しました。残念ながら、これらの研究は、これらの系統に含まれる新しい四倍体系統と背景遺伝子マーカーを生成するの難しさによって限られていた。ここに示す、減数分裂27の間にシナプスの制御を勉強する菌株を生成するために使用されている安定した四倍体を生成する簡単かつ迅速なプロトコルです。
自然、半数体の配偶子ではなく二倍体の形成によって polyploidization が発生します。四倍体の子孫 (図 1)27の生産に減数分裂固有コヒーシン コンポーネント変異rec 8倍精子を生成して、 rec 8遺伝子ノックダウン卵母細胞が示された私達の見つけることになります 28,29。四倍体菌株を生成する単にノックダウンrec 8 RNA 干渉 (RNAi) phenocopy rec 8に 2 つの世代のために突然変異体の二倍体の配偶子が含まれます。彼らの長いによって推定される倍数体を簡単に識別できます通常の体のサイズよりも。倍数体は、安定したラインが確立されたら核あたりの染色体の数を数えることによって完全または部分的な四倍体で確認しています。
ここで説明されている方法では、初期の二倍体遺伝的背景または遺伝標識を使用せず核型から安定した四倍体の線虫線虫の系統の生成を可能。 にします。このプロトコルはより効率的、汎用性の高い、かつ以前を使用する方式よりも単純なため、拡大する開発、ゲノムの安定性と多細胞の進化の基本的なプロセスで polyploidization の役割を照会するために必要なツール生物。このプロトコルの使用で唯一可能な制限は、RNAi に耐性の遺伝的背景です。
半数体 (n) 配偶子の受精で二倍体 (2 n) の受精卵を生成するキーです。ゲノムのこの減少は、2 つ連続して細胞分裂と減数分裂の間単一ゲノム重複後に達成されます。半数体を生成する配偶子、線虫、他のほとんどのリザーバーと分離第一部門で母性と父性の由来同族体に対し妹各相同から染色分け体は 2 部で分離します。ゲノムの倍数性が自然に発生する方法 1 つはゲノムのサイズの半分に減数分裂に失敗した配偶子の生成です。
その倍が 50 年以上にわたって知られているC. elegans線虫が実行可能、肥沃な。ニゴン:23と後から Madl とハーマン22、生成され、減数分裂期染色体分離を中断することによって線虫四倍体の一握りを識別熱ショック療法を使用して、それぞれ遺伝子マーカーを使用します。追加シングルc. briggsae四倍体株は 30 年以上このプロトコルを使用して派生した後24。これらの四倍体は線虫を調べるになったり男性両性、倍数性成長とサイズを調節する方法とペアリングと減数分裂25,26,でシナプスを分析するかどうかを調査を利用しました。38,39,40。 まだこれらと他の研究は、特定の四倍体、三倍体系統を使用する必要がこのメソッドによって四倍体菌株を生成する難易度が限られていた。
ここで説明されているプロトコルは安定したフル 4 a, 4 X の生成を有効化や二倍体遺伝的背景の初期部分 4 a、3 X 4 倍体線虫線虫株いずれかから遺伝標識を使用せず核型
Tetraploidy線虫のメカニズムの 1 つ以上発生します。
Madl とハーマンは、彼らは可能性があります生成された四倍体系統が三倍体中間状態から派生したことを示唆しました。彼らの緊張は、複数世代にわたって、推定三倍体、二倍体雄22の中間を交差選択により得られました。染色体が二倍体の卵細胞と精子を生じrec 8変異体の分割の欠陥は、 rec 8 RNAi 方式27四倍体の動物を生じる別の可能な機構を提案します。
二倍体の卵母細胞、精母細胞、受精時に四倍体の動物に上昇を与える、 rec 8 RNAi 扱われる両性具有は作り出すことができます。この可能性と一貫性のあることクローンとして作られた F2 の両性具有のいくつかに上昇した安定した経度系統示唆している次世代のクローンの経度 F2 両性具有という事実は、ここで既に四倍体。交差方式でrec 8 RNAi 扱われる両性具有の第一世代は未処理の男性と交差します。二倍体精母細胞まだ男性十字架はrec 8 dsRNA を表現する細菌の存在下で行われ、したがって、男性、少なくとも 3 日間交尾中にrec 8 RNAi にさらされているので起こることができます。したがって、cross-fertilizing 方式で経度倍数体にも二倍体の卵母細胞の受精から形成二倍体精子があること。安定した四倍体系統は、二倍体の配偶子の間どちら施肥や半数体精子を生産 2 倍体の動物と変数の倍数性の卵母細胞を含む三倍体の動物の交差から生じることがあります。
重要な考慮事項:
自己・受精と:
Rec 8 RNAi を自殖性の方式は、F1 の両性具有を扱われ、未処理男性両方で扱われる両性具有の交差を含むスキームは、4 a、4 X に上昇を与えた、4 a、3 X 4 倍体系統。多くの倍数体が自家受精のスキームから最初に分離されたものの、これらの倍数性動物の多くが滅菌された、両方の方式ある同様に効率的に生産四倍体の安定株。高められた成功と自己肥やすスキームにおける不稔発生の理由は不明のまま。両方の方式が同様に効率的、自家受精方式交配のため男性の分離を必要としない簡単です。さらに、関心のひずみが非能率的なかで嵌合不良、自家受精方式が望ましかった。Cross-fertilizing スキームは、単一の染色体の 2 つ以上のバージョンを含む複雑な四倍体を生成に使用する可能性があります。
変更と限界:
現在、このプロトコルには、 rec 8遺伝子の dsRNA を表現する細菌を供給することによりrec 8 RNAi 治療が含まれます。したがって、このプロトコルでは働きません線虫種 RNAi に応答しない給電、または変異体組織41,42,43の RNAi の環境または全身性のスプレッド。生殖に直接関心の dsRNA の直接注入による RNAi 治療を導入することによりこの問題を解決可能性があります可能性があります。
三倍体の動物は、この方式は、安定した三倍体系統44,45を生成しませんので、派生した二倍体動物に四倍体を交配することによって生成されなければなりません。卵の 15% だけは、三倍体ハッチによって気もち、彼らの子孫は異数性による滅菌子孫主です。さらに、ほとんどの存続の肥沃な子孫は数世代以内完了前後の切片をする傾向がありません。これはおそらく、少なくとも部分的には、卵母細胞が第一減数分裂で極体に 3 番目の染色体を分離してトリソミーを部分的に修正されているので。
このプロトコルの克服できない制限は、RNAi 治療46にくいので RNAi 機械のコンポーネントに影響を与える突然変異体の四倍体を作るため働かないことです。
トラブルシューティング。
rec 8 RNAi:
いくつかの考慮事項が成功するためにこのプロトコルの重要です。最初は、 rec 8 dsRNA rec 8 (W02A2.6) クローンを行う細菌 HT115 細菌産生の誘導に新鮮な IPTG とたて IPTG NMG プレートを使用することです。IPTG は光に敏感とプレートに光の露出を減らすことが重要です。IPTG プレートは、暗闇の中で 4 ° C で 1 ヶ月分保存できます。第二に、Ahringer ライブラリ (Kamath および Ahringer 2003) からのrec 8 (W02A2.6) の RNAi 細菌 HT115 の緊張は他の利用可能なrec 8よりも強いrec 8表現型の HT115 クローンをもたらした。
四倍体のひずみのメンテナンス:
四倍体系統は非常にゆっくりと成長し、世代47あたりせいぜい 50 後代を生成します。すべての識別された四倍体系統が比較的安定しているが、打破でき、二倍体のとき強調 (ジョナサン ・ ホジキン個人的なコミュニケーションと未発表察) になります。したがって、餓死、25 ° c で熱ショックによる四倍体系統が栽培されてまたは冷凍、吉濱彼ら急速に戻すことがクラシファイヤシステム、これらの系統を解凍するときにイオン動物を選ぶを継続する上で重要なまたはときに注意することが重要です。これら系統に戻すそれらを引き起こす可能性がありますストレスの多い状況を公開します。
可能なアプリケーション:
効果の調査または多細胞生物における遺伝子発現、細胞周期進化ゲノム polyploidization の役割の比較に依存している: 同じセル異なる倍数を含む有機体のセル種類に密接に関連して異なる倍数性種や進化的近況 polyploidization および物理的な分離3,5,6,7,8 を受けた種 ,11,18,19,20,48,49,50。四倍体は、ゼブラフィッシュおよびマウスのモデル システムから派生することができます、彼らの子孫は滅菌または致命的な強肩16,17。また、これらのモデル システムc. の elegansに比べて長いライフ サイクル、倍数体の動物を生成する使用可能なメソッドは、複雑で非効率的な.したがって、このメソッドによって派生した線虫の系統は効果と全ゲノム多細胞生物における倍数性のロールに任意の調査を促進するため尽力されます。
三倍体は、元の二倍に、四倍体を交配することによって四倍体から派生することができます、ので二倍体、三倍体、四倍体ゲノムのコピーの数の表記だけが異なると比較がユニークで前例のない機会を提供します異なるゲノムのサイズ (または遺伝子投与) の等価動物、器官、細胞を評価します。柔軟性とここで説明した方式の容易さ二倍体の異なる遺伝的背景や染色体から四倍体株の多数を生成することができました。これらの系統の一部は既に減数分裂27の間に相同染色体対とシナプスのクエリ メカニズムに使用されました。
蛍光マーカーを運ぶ野生型と変異体の四倍体系統はスケーリング、全ゲノム細胞内/携帯/オルガンと全体の動物のゲノムのサイズと核/細胞質比の間の関係を理解するための調査の新しい道を提供します。適応、種分化、遺伝子量と表現、および組織と器官の開発に polyploidization。生物学的スケーリングに関する研究、ほか四倍体系統の世代が大幅さらに細胞外シグナル、ゲノム不安定性、表現、全ゲノムに関連する基本的な生物学的質問のクエリ重複、遺伝子量、ストレス、医薬品、および種分化の機構への抵抗の開発に適応。
The authors have nothing to disclose.
私たちは緊張のため (国立衛生研究所 (NIH) 事務所の研究基盤プログラム P40 OD010440 出資) 線虫の遺伝学センターを感謝します。著者は、建設的なフィードバック、ccny、撮影の部分と彼らの支援のための彼らの実験室の使用のためニューヨーク市立大学真野研究室をご提供するバティスト Roelens と Eli Lessman を感謝したいです。この作品は、PSC CUNY 賞 TRADB-46-113 支えられて、NIH 付与 1SC2GM118275-01。社は、NIH/日の出の上昇によって支えられ、修士は健康 (機構) サキヤマ, のカナダの研究所によって部分的に支持された GM062981 を付与します。
Dissecting Microscope | Motic Microscopy | SMZ171 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
NGM agar plates | |||
60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3305 | |
35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3500 | |
Bacteriological Agar, 5 kg | VWR | 89140-850 | |
Sodium Chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
Peptone, BD Bacto | VWR | 90000-368 | |
Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
IPTG, dioxane-free | Thermo Scientific | R0391 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Growth Culture | |||
LB Lennox Broth | IBI Scientific | 89126-176 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
LB Agar plates | |||
LB Agar Lennox | IBI Scientific | 89126-182 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibiotics | |||
Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Staining | |||
Hoechst 33258, Pentahydrate | Biotium | 40045 | |
DAPI | Biotium | 40011 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol Fixation | |||
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP | Koptec, VWR | 89125-166 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
M9 Buffer | |||
Sodium chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade | VWR | 97062-346 | |
Sodium phosphate, monobasic dihydrate | Fisher Scientific | AC271750025 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RNAi Clones | |||
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Source Bioscience | W02A2.6 | |
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Dharmacon | RCE1182-202299820 |