JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetica

التلاعب في بلويدي في ايليجانس كاينورهابديتيس

Published: March 15, 2018
doi:
10.3791/57296
, , , ,
1Brooklyn College, Biology Department,City University of New York, 2The Graduate Center, Biology Department,City University of New York, 3Advanced Science Research Center,City University of New York

Summary

يسمح هذا الأسلوب لتوليد الحبليات كاينورهابديتيس tetraploid والكروموزوميه من أي سلالة مثنوية. الكروموزومية السلالات التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الأسلوب قد استخدمت لدراسة التفاعلات بين كروموسوم في الطور الأول هو، ويعد هذا الأسلوب مفيداً لدراسة المسائل الأساسية الهامة في الخلية، الإنمائية والتطورية، وبيولوجيا السرطان.

Abstract

آليات لإشراك كامل الجينوم بوليبلويدي دوراً هاما في التنمية والتطور؛ أيضا، لقد ارتبطت جيلا غير طبيعي للخلايا تيترابلويد مع تطور السرطان وتطوير المقاومة للعقاقير. وحتى الآن، لم ممكناً بسهولة التلاعب ploidy حيوان متعددة الخلايا دون توليد معظمهم من نسل العقيمة. قدم هنا بروتوكول بسيط وسريع لتوليد tetraploid ايليجانس كاينورهابديتيس الحيوانات من أي سلالة مثنوية. هذا الأسلوب يسمح للمستخدم بإنشاء وجود تحيز في العزل الكروموسومات أثناء الانقسام الاختزالي، في نهاية المطاف زيادة ploidy في C. ايليجانس. هذه الاستراتيجية تعتمد على تخفيض عابر للتعبير عن الجين 8 تفصيل لتوليد ضعفاني الأمشاج. متحولة 8 تفصيل تنتج الأمشاج ضعفاني يمكن أن يحتمل أن تنتج تيترابلويدس على الإخصاب. وقد استخدم هذا المخطط يستهدف توليد سلالات tetraploid تحمل الطفرات وترتيبات جديدة كروموسوم التبصر في ديناميات الصبغية والتفاعلات أثناء الاقتران وتشابك في الانقسام الاختزالي. هذا الأسلوب هو كفاءة لتوليد سلالات tetraploid مستقرة دون علامات وراثية ويمكن تطبيقها على أي سلالة مثنوية ويمكن استخدامه لاستخلاص الكروموزومية C. ايليجانس. هذا الأسلوب مباشرة مفيدة للتحقيق في مسائل أخرى البيولوجية الأساسية ذات الصلة بالجينوم عدم الاستقرار، الجرعة الجينات، القياس البيولوجي، مما يشير إلى خارج الخلية، والتكيف أن أشدد، بتطوير مقاومة للأدوية، و آليات انتواع.

Introduction

بوليبلويدي كامل الجينوم موجود في جميع أنحاء الطبيعة وغالباً ما يكون خطوة ضرورية للتكيف، انتواع، organogenesis، والتئام الجروح، والقياس البيولوجي؛ ومن المعروف أيضا تعزيز كل من السرطان ومقاومة للعقاقير1،2،3،4،،من56،،من78، 9 , 10 , 11 , 12-إنشاء صناعات الزراعة ومصايد الأسماك الكروموزومية النباتات والأسماك والمحار بالعلاج الكيميائي (مثلاً، كولشيسين وأورزالين) للحصول على معدلات نمو أسرع وأضخم المحاصيل والثروة الحيوانية13، 14،15. الإنتاج التجريبي وغير كفؤة من تيترابلويدس موجود للماوس والزرد نموذج نظم16،17. ومع ذلك، معظم أو جميع الكروموزومية الحيوانات متعددة الخلايا التي تم إنشاؤها بشأن قاتلة أو عقيمة وهكذا ليست مثالية للدراسات المختبرية على آثار بوليبلويدي في أحد الكائنات متعددة الخلايا. ونتيجة لذلك، أي تفهم للجينوم كله بوليبلويديزيشن في الكائنات الحية متعددة الخلايا كانت محدودة للأنواع ذات صلة وثيقة من التطور الأخير بوليبلويديزيشن الأحداث18،19،20 . طريقا للمضي قدما الاستعلامات الدور البيولوجي أو عواقب بوليبلويديزيشن هو استخدام النظام النموذجي C. ايليجانس . الأهم من ذلك، هو C. ايليجانس نظام وراثية تتسم عادة موجود مثنوية، يحتوي على خمسة فقط أوتوسوميس (A) وواحد كروموسوم الجنس (X) كل الجينوم، شفافة مما يسمح بالمراقبة في فيفو من العمليات البيولوجية، و وقد لها دورة حياة قصيرة من 3-4 أيام (من البيض للكبار ناضجة جنسياً). وقد ثبت C. ايليجانس ليتمكن من إنتاج تيترابلويد، وهو النوع الأكثر شيوعاً من الجينوم كله بوليبلويدي في الطبيعة. الكروموزومية الحيوانات يمكن إنشاؤها بواسطة عبور تيترابلويدس مع ديبلويدس، ولكن بهم ploidy ليست مستقرة، والسلالات تصبح مثنوية في غضون بضعة أجيال.

في العقود القليلة الماضية سوى حفنة من صالحة وخصبة C. ايليجانس سلالات تيترابلويدس كانت معزولة في المختبر، باستخدام استراتيجية هي شاقة ويولد سوى أنواع محدودة من السلالات21،22، 23. ينشئ هذه الاستراتيجية تيترابلويدس C. ايليجانس بعلاجات الصدمة الحرارة، التي يفترض أن يؤثر على العزل الصبغي في الأمشاج، متبوعاً بفرز الحيوانات الكروموزومية المفترضة باستخدام البصمات الجينية. هذه تيترابلويدس كانت مفيدة للغاية في الاستفسار من كيف هذا ديدان أسطوانية يحدد ما إذا كان ينبغي أن تصبح الذكور أو خنثي. الدراسات في وقت لاحق استخدام سلالات المتاحة للتحقيق في النمو، والجرعة الجينات، والتنظيم لتشابك أثناء الانقسام الاختزالي في هذا السلكية21،24،،من2526. للأسف، أن هذه الدراسات كانت محدودة بسبب الصعوبة في توليد سلالات تيترابلويد جديدة والبصمات الجينية خلفية هذه السلالات الواردة. يظهر هنا هو بروتوكول بسيط وسريع لتوليد تيترابلويدس مستقرة، التي استخدمت لتوليد سلالات لدراسة تنظيم تشابك أثناء الانقسام الاختزالي27.

كما هو الحال في الطبيعة، يمكن أن تنشأ بوليبلويديزيشن بتشكيل ضعفاني بدلاً من الأمشاج فرداني. لدينا استنتاج أن يولد المسخ مكون 8 تفصيل كوسين حدة الانقسام مثنوية الحيوانات المنوية وبويضات أشارت إلى أن هدمت الجين rec-8 سيؤدي إلى إنتاج ذرية تيترابلويد (الشكل 1)27، ،من 2829. توليد سلالات tetraploid ينطوي ببساطة هدمت 8 تفصيل بتدخل الجيش الملكي النيبالي ([رني]) لجيلين من أجل فينوكوبي تفصيل-8 الأمشاج مثنوية المسخ. يمكن بسهولة تحديد polyploids المفترضة قبل انتهاء فترة أطول من حجم الجسم الطبيعي. تأكدت polyploids تيترابلويدس كاملة أو جزئية بإحصاء عدد الكروموسومات في نواة حالما يتم إنشاء خطوط مستقرة.

الاستراتيجية المذكورة هنا يمكن توليد مستقرة tetraploid كاينورهابديتيس سلالات السلكية من أي خلفية الوراثية مثنوية الأولية أو تناذر دون استخدام البصمات الجينية. أن هذا البروتوكول أكثر كفاءة وتنوعاً، وبسيطة من مخطط المستخدمة سابقا، وستوسع الأدوات اللازمة للاستعلام عن أدوار بوليبلويديزيشن في العمليات الأساسية للتنمية والاستقرار الجينوم والتطور في متعددة الخلايا الكائنات الحية. تحديد المنظور فقط في الاستخدام هذا البروتوكول في الخلفيات الوراثية مقاومة إلى [رني].

Protocol

1. إعداد “التسجيل” rec-8 [رني] (1-3 اليوم في الشكل 2) يتم تعديل هذا البروتوكول من كاماث وأهرينجير30. لتحريض rec-8 دسرنا التعبير في الإشريكيّة القولونية، إعداد لوحات أجار المتوسطة النمو ديدان أسطوانية (NGM)31 تستكمل بتركيز نهائي من 1 مم الأيزوبروبيل-β-د-2-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) و 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. تخزين في الظلام في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام، لمدة تصل إلى 4 أسابيع. بكتيريا HT115 متواصلة تحمل استنساخ rec-8 (W02A2.6) من30 مكتبة مختبر أهرينجير 8 تفصيل استنساخ على لوحات مرق لوريا (رطل) وتستكمل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين والتتراسيكلين 50 ميكروغرام/مل. تنمو بين عشية وضحاها في شاكر عند 37 درجة مئوية. في يوم 1، تطعيم المستعمرات واحدة من المستعمرات ستريكيد طازجة واحدة من بكتيريا HT115 كولاي تحمل الاستنساخ [رني] 8 تفصيل إلى مل 4 رطل تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين والتتراسيكلين 50 ميكروغرام/مل. تنمو ثقافة البكتيريا بين عشية وضحاها في شاكر أو طبل اسطوانة عند 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي (يوم 2)، الحث على إنتاج مزدوج تقطعت بهم السبل (ds) الجيش الملكي النيبالي ل تفصيل-8 W02A2.6 في ثقافة HT115 البكتيرية عن طريق إضافة تركيز نهائي من 1 مم إيبتج وتهتز لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد التعريفي، والبذور لوحات NGM/إيبتج مع 100-200 ميليلتر من البكتيريا rec-8 HT115 وتخزين لوحات في درجة حرارة الغرفة في ليل الظلام (3 يوم). في صباح اليوم التالي (4 يوم)، إضافة سلالة السلكية المطلوب إلى لوحات البكتيريا rec-8 HT115 المستحثة كما هو موضح في الخطوة 2، 1 أدناه. 2-توليد وعزل تيترابلويدس (يوم 4-16 في الشكل 2) في يوم 4، ضع الشباب 3-4 L4 (اليرقات الرابعة) مرحلة المنحرفين من سلالة مثنوية المرجوة على لوحات نمج/إيبتج المصنف مع HT115 8 تفصيل البكتيريا التي قد حملت في اليوم السابق (خطوة 1.5، أعلاه). تنمو الديدان الخيطية في 15 درجة مئوية في الظلام. كرر الخطوات من 1.3 و 1.4 ابتداء من 3 أيام بعد الخطوة 2-1، التي ستكون ثلاثة أيام قبل أن تصبح ذرية الأولى (F1s) من تلك الخطوة L4s. أن توقيت هذه الخطوة سوف يعتمد على مدى سرعة سلالة السلكية ينمو في 15 درجة مئوية. بعض سلالات متحولة مثنوية المزارعين بطيئة، وهذا التوقيت سوف تحتاج إلى دفع غرامة ضبط بغية عزل تيترابلويدس. في يوم 8 (بعد 4 أيام من تفصيل-8 [رني] التغذية العلاج)، نقل 20 (طبق بيتري المنحرفين/2) من المنحرفين L4 F1 (الجيل الأول للأبناء) يزرع في البكتريا rec-8 HT115 على HT115 طازجة المستحث rec-8 [رني] والسماح سيلففيرتيليزي لهم. بدلاً من ذلك، نقل 20 من المنحرفين F1 L4 تزرع في البكتيريا rec-8 HT115 على الطازجة التي يسببها HT115 rec-8 [رني] البكتيريا جنبا إلى جنب مع الذكور غير المعالجة من نفس السلالة (المنحرفين 2 مع الذكور/لوحة 4-6). في يوم 13، بدء فحص F2 (الجيل الثاني الأبناء) ذرية التي تظهر طويلة (Lon) أو أكبر عموما من نوع البرية؛ ثم نقل الحيوانات الطول الفردية على سلالات OP50 أو HB101 العادية من البكتيريا كولاي . مواصلة فحص F3 ذرية (الأبناء الثالثة)؛ بيد أن ذرية F3 من لوحة نفسه لا تعتبر سلالات مستقلة إذا أنها ترسخ، لأنها يمكن أن تكون الأشقاء من نفس المنشأة بالفعل الأم F2.ملاحظة: تيترابلويدس المفترضة يتم التعرف عليها بسهولة لأنها أطول من الواضح من ديبلويدس. نوع البرية المنحرفين هي ثلثي أقصر من تيترابلويدس. هيئة تيترابلويد لأنها أطول، يجعل بدوره إضافية وهي تتحرك إلى الأمام بتوليد موجات جيبية منحنية الجسم من الرأس إلى الذيل (الشكل 3A). السماح بالطول الديدان سيلففيرتيليزي ونشر بانتقاء ذرية الطول حتى يتم أنجب ذرية الطول فقط في غياب 8 تفصيل العلاج [رني]. قد يستغرق هذا شهرين أو ثلاثة أجيال إضافية. الديدان الطول غالباً عقيمة ولا تسفر عن ذرية. 3-التحقق من سلالات Tetraploid (فيلم 1 و الشكل 3 ألف، باء) ملاحظة: يمكن التحقق من سلالات Tetraploid بإحصاء عدد الكروموسومات في بويضات المخصبة بهم. يمكن استخدام مجهر فلوري الشاشة لعدد أزواج الكروموسومات في بويضات المخصبة مثنوية (قبل الشعب هو)، إذا كان الضغط علامة مضيئة للكروموسومات. نظراً لغياب علامات كروموسوم الفلورسنت، يمكن فحص الديدان الخيطية تيترابلويد من خلال تحديد الديدان الخيطية وصبغة بصبغة الحمض النووي؛ انظر أدناه لوضع بروتوكول لتحديد الإيثانول و 4 أسرة والحيوان، تلطيخ هيدروكلوريد 6-دياميديني-2 ‘–فينيليندولي (DAPI). الحيوان كله تلطيخ DAPIملاحظة: سلالات Tetraploid تحمل 12 كروموسوم متصل أزواج يمكن أن يقرها DAPI تلطيخ هذه الحيوانات وإحصاء عدد الهيئات DAPI في به بويضات المخصبة. ثم نقل مكان 5 إلى 10 ميليلتر من المخزن المؤقت M931 على شريحة مجهر، الحبليات 6-10 إلى الانخفاض. تحت مجهر تشريح، رسم معظم M9 من الإسقاط دون إزالة للخيطيات مع أنسجة تنظيف خالية من الوبر. ثم فورا إضافة قطره 10 ميليلتر من الإيثانول 90% على الديدان. تسمح الديدان لتجف تماما، ولكن لمدة لا تتجاوز بضع ثوان. بمجرد أن يتبخر الإيثانول (وهذا يمكن اعتبار أنه يحدث تحت مجهر تشريح)، إضافة ميليلتر 10 إضافية من الإيثانول 90% على الديدان. كرر الخطوة 3.1.3 ثلاث مرات أكثر. مرة واحدة وقد تبخرت آخر قطره من الإيثانول، إضافة 6 ميليلتر لصبغ DAPI أو هويشت في تركيز النهائي الموصى بها في وسائل الإعلام المتزايدة لاختيار (على سبيل المثال، 1:1,000 إضعاف تركيز المخزون في M9 DAPI 2 نانوغرام/ميليلتر). للتخزين على المدى الطويل من الشرائح، ويمكن استخدام 0.5% p-فينيلينيدياميني حله في 20 مم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 8.8، في والغليسيرول 90% كحل أنتيفادي، بدلاً من M9 فقط،. تغطي الديدان على الشريحة مع ساترة وختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر. نقاط في مجهر الأسفار (الخطوة 3.1.7) على الأقل 10 دقيقة بعد إضافة ساترة. ويمكن تخزين الشرائح دون أنتيفادي لبضعة أيام في 4 درجات مئوية قبل التسجيل، ولكن نوعية fluorescence يبدأ في الانخفاض بعد أيام قليلة. استخدام مجهر فلوري في 100 X التكبير، نقاط عدد الهيئات DAPI واحد (كروموسوم واحد يفترض أن أزواج) في البويضات المخصبة الأكثر نضجاً، الذي هو متاخم سبيرماثيكا ولم تدخل بعد في سبيرماثيكا أو الرحم. إلى نقاط فرادى الهيئات DAPI داخل نواة بويضتها، استخدام مجهر غرامة التركيز إلى التحرك ببطء من الجزء العلوي من نواة بويضتها للأسفل أثناء العد. ثم، إعادة عد نواة نفسه بينما نقل التركيز في الاتجاه المعاكس (أي، من أسفل إلى الأعلى من النواة) للتأكد من عدد الأصوات التي تم فرزها من الهيئات DAPI. نقاط البويضيه المخصبة الأكثر نضجاً في كل من الغدد التناسلية اثنين في المنحرفين على الأقل عشرة كل سلالة الطول مستقرة. وقد بويضات نوع البرية 6 هيئات DAPI في المتوسط، 5 أوتوسومي أزواج وزوج كروموسوم الجنس. وجود 12 جثة DAPI في البويضات ثابتة الطول سلالات يشير إلى أن الحيوانات في هذه السلالة هي جزئية (4 مجموعات من أوتوسوميس، إكستشروموسوميس 3) أو (4 مجموعات كاملة من أوتوسوميس، إكستشروموسوميس 4) تيترابلويدس. حساب متوسط عدد الهيئات DAPI ملاحظته من بويضات متعددة (10 على الأقل) كل سلالة. سوف يكون لمس بعض أزواج الكروموسومات أو على حق غالباً ما أعلى من بعضها البعض، حيث عدد DAPI الهيئات في البويضات أصغر من العدد الفعلي لأزواج الكروموسومات. (اختياري) كذلك التحقق من سلالات الطول مستقرة حيث متوسط عدد من الهيئات DAPI هو 12 اختبار ما إذا كان هم كامل (4A، 4 X) أو جزئي (4A، 3 س) تيترابلويدس من الفلورة تلطيخ ضد كروموسوم محور البروتينات مثل المشاركة-332. هذا تلطيخ سيميز أزواج الكروموسومات بإظهار نمط كروسيفورم من الكروموسومات لا صلة واحدة موجودة في تيترابلويد الجزئي.

Representative Results

الأضرار تفصيل-8 “كوسين هو مكون وظيفة النتائج” في “الأمشاج مثنوية”: التصوير من الشعب هو كوسين مكون متحولة rec-8 الحيوانات المنوية وبويضات كشف الآليات الممكنة لتوليد الحيوانات تيترابلويد (الشكل 1)27،،من2933. ميتشانيستيكالي، عيوب شعبة هو 8 تفصيل متحولة السائل المنوي والبويضات مختلفة؛ ومع ذلك، الأمشاج مثنوية ذكوراً وإناثاً تنتجها المسخ rec-8 . في نوع البرية الانقسام الاختزالي، تصبح مؤقتاً متصلة ببعضها البعض بواسطة جزئ كروس الكروموزومات المتماثلة وأدخل شعبة هو أول وحدة أو موعدا (الشكل 1A)34. خلال الشعبة الأولى، فصل الكروموزومات المتماثلة (homologs) بعيداً عن بعضها البعض، بينما الأخت شقاً الصبغي في كل هومولوج البقاء معا حتى الدرجة الثانية. على الرغم من أن نمط الفصل الصبغي هو نفسه في الأمشاج الذكور والإناث، الشعب البويضيه غير متماثل بينما الشعب spermatocyte متماثل والخضوع cytokinesis متخصصة. في كل شعبة، يتجاهل البويضات نصف المنتج شعبة في هيئة القطبية صغيرة. وهكذا، يثير كل السلائف البويضات إلى واحدة من البويضات فرداني وجثتين القطبية (الشكل 1، ج)35. على العكس من ذلك، تمهيدا سبيرماتوسيتي واحد يثير لوحظت الفنية الأربعة التي تمر شعبتين متماثل. الشعبة الثانية يتوج مع أربعة لوحظت مهدها قبالة من هيئة متبقية. هذا سيتوكينيسيس خاص في ذلك نمط وعدد لوحظت يتحدد سينتروسوميس36. في سلف الأمشاج متحولة rec-8 ، ممارسو التقاطع بين الكروموزومات المتماثلة لا يأخذ مكان وغير متصل homologs موعدا بداية من29،شعبة هو أول34. فصل شقاً الصبغي الشقيقة من كل هومولوج بعيداً عن بعضها البعض في الشعبة الأولى بدلاً من البقاء معا حتى الدرجة الثانية، كما يفعلون في نوع البرية الأمشاج. من المثير للاهتمام، النمط الظاهري متحولة تفصيل-8 خلال الشعبة الثانية مختلفة في الأمشاج الذكور والإناث في أن تفشل بويضات الخضوع سيتوكينيسيس في حين يخضع spermatocytes cytokinesis عادية نسبيا (الشكل 1B– و) 27 , 28 , 29-بويضات مثنوية تنشأ لأنه تفشل في الشعبة الثانية العزل الصبغي وسيتوكينيسيس، ومن ثم لا بثق الجسم القطبي الثاني (الشكل 1، ج). سبيرماتوسيتيس في جيرملينيس 8 تفصيل الخضوع مهدها النطف أو سيتوكينيسيس، ولكن غالباً ما تفصل بين هاتين المجموعتين من الكروموسومات إلى أحد لوحظت تؤتي النطف ضعفاني والنطف التي تفتقر إلى الكروماتين (الشكل 1– و)27. ويبين الشكل 1Fالتحديد الكمي لنسبة الحيوانات المنوية 8 تفصيل تفتقر إلى الكروماتين. واقترح تشكيل الأمشاج ضعفاني الذكور والإناث في طفرات rec-8 أنه يمكن استخدام هذا النمط الظاهري المسخ يحتمل أن تكون لتوليد سلالات tetraploid الجينوم الكامل. توليد سلالات Tetraploid C. ايليجانس : يمكن تجنب وجود طفرة في الجينات rec-8 في جميع سلالات تيترابلويد الذي تم إنشاؤه بعابر هدمت rec-8 [رني]29،37. وهذا يفترض أن يولد الحد وظيفة تفصيل-8 [رني] مثنوية الأمشاج التي يمكن أن تؤدي إلى الجينوم كله tetraploid الحيوانات، كما تفعل طفرات rec-8 29،37. الأساسية لهذا البروتوكول هو أن طفرات 8 تفصيل كل تؤدي إلى الأمشاج ضعفاني والمولى عدد معقول من الشباب، خلافا لسائر طفرات هو، التي تؤدي إلى الأمشاج أنيوبلويد، وهي غالباً عقيمة أو الجنينية/اليرقات الفتاكة. سلالات تيترابلويد متعددة تم إنشاؤها بواسطة تغذية البكتيريا C. ايليجانس الإعراب عن دسرنا rec-8 استخدام أيا من هاتين الاستراتيجيتين (انظر البروتوكولو الشكل 2و الجدول 1)27. يمكن أن تتولد تيترابلويدس من المنحرفين تخصيب ذاتي لثلاثة أجيال في أطباق بتري مع البكتيريا معربا عن دسرنا rec-8 . بهذه الاستراتيجية خنثي يوضع في طازجة منقولا تفصيل-8 [رني] لوحات وذرية بضعة أيام في وقت لاحق على لوحات جديدة مع طازجة المستحث rec-8 [رني] وإذ تعرب عن البكتيريا (انظر البروتوكول). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إنشاء تيترابلويدس من خلال معبر الجيل الأول من المنحرفين تغذية البكتيريا معربا عن دسرنا rec-8 مع الذكور غير المعالجة من نفس النمط الوراثي في أطباق بتري مع البكتيريا معربا عن دسرنا rec-8 ( الشكل 2). وفي هذه الحالة، يتعرض الذكور في الصليب للبكتيريا [رني] 8 تفصيل من مرحلة L4 فصاعدا، أثناء التزاوج. كلا مخططات تثير الحيوانات تيترابلويد27. ويبين الجدول 1 سلالات تيترابلويد التي تم الحصول عليها باستخدام الخطة المعروضة هنا. الكروموزومية و tetraploid C. ايليجانس أكبر في الحجم من ديبلويدس، ولكن سلالات الكروموزومية غير مستقرة وتميل إلى أن تصبح مثنوية في الأجيال واحد أو اثنين، بينما هي سلالات tetraploid مستقرة نسبيا22،23. واعتبرت سلالات tetraploid المفترضة أكبر من المنحرفين السلالة (الطول) الأصلي الذي أنجب فقط الطول ذرية (الشكل 3A). لون الحيوانات يتم التعرف عليها بسهولة–الحيوانات البرية نوع مثنوية ثلثي طول تيترابلويدس ولا تجعل أجسادهم منحنى إضافية، التي يمكن أن تكون لاحظت أثناء حركتها إلى الأمام جيبية (الشكل 3A). وأكد سلالات tetraploid الكشف عن وجود أزواج كروموسوم 12 في بويضات من المنحرفين tetraploid مقارنة بستة أزواج الكروموسومات في بويضات من المنحرفين مثنوية (الشكل 3، ج، و فيلم 1). تيترابلويد فئات: وتم تحديد نوعين من المنحرفين تيترابلويد: أحد الذكور أنجب ترددات مشابهة كالمنحرفين مثنوية والآخر أنجب الذكور في كثير من الترددات العالية (الجدول 1). هذين النوعين من المنحرفين tetraploid قد ثبت أن تختلف في ذلك الترددات فئة إنتاج مماثلة للذكور ضعفاني tetraploid لجميع الكروموسومات به (4A، 4 X)، بينما الترددات العالية الطبقة المنتجة للذكور المنحرفين التي تيترابلويد أوتوسوميس ولكن الكروموزومية كروموسوم الجنس (4، 3 س). الفئة الأحدث من تيترابلويدس مستقرة وإنتاج 4A، 3 X المنحرفين و 4A، 2 X الذكور. سلالات تيترابلويد تنمو بشكل أبطأ وتنتج تخفيض حجم الحضنة مقارنة diploids أنها مستمدة من، كما ينظر للسلالات التي تم إنشاؤها مع22،الأسلوب السابق23. مادل وهيرمان22 اقترح زيادة نسبة أجنة ميتة في سلالات تيترابلويد يمكن أن يكون سبب انيوبلويدي في البويضات، ولكن التفتيش سطحية من سلالات tetraploid لم تكشف بما فيه الكفاية ارتفاع الأرقام من أنيوبلويد بويضات ولا البويضات غير طبيعي أو الشعب سبيرماتوسيتي لحساب التخفيض الملحوظ في حجم الحضنة (2 الفيلم، و الشكل 3د). الشكل 1: الجاميطات في المسخ rec-8 يعني الآليات الممكنة لتوليد مستقرة البقع الكروموزومية. (أ) رسم تخطيطي من نمط كروموسوم المنظمة والعزل في الانقسامات هو المسخ نوع البرية و تفصيل-8 . في نوع البرية الانقسام الاختزالي، فصل الكروموزومات المتماثلة في الشعبة هو الأول. توجه نحو القطب المغزل نفس شقاً الصبغي الشقيقة في كل هومولوج والبقاء معا حتى الدرجة الثانية. في طفرات rec-8 ، هومولوجس لا تشكل عمليات الانتقال، وحتى لا تكون متصلاً. على النقيض من ذلك نوع إلى البرية، الأخت 8 تفصيل شقاً الصبغي توجيه بعيداً عن بعضها البعض وفصل في شعبة هو أول. (ب) رسم تخطيطي من نوع البرية ومتحولة بويضات تبين برونوكليوس الإناث ومقذوف الهيئات القطبية (لا يصور برونوكليوس الذكور). بويضات نوع البرية، إلى شعبتين هو غير متماثل البثق للهيئتين القطبية. في طفرات rec-8 إلا أن يفشل بثق الجسم القطبي الثاني أسفر عن البويضيه مثنوية. (ج) صور من بويضات متحولة نوع البرية و تفصيل-8 معربا عن mCherry::histone H2B. تشير الأسهم إلى الهيئتين القطبية في بويضتها نوع البرية وواحدة في المسخ rec-8 . شريط مقياس هو 5 ميكرومتر. (د وه) “يعيش صور” لوحظت من الحيوانات المسخ نوع البرية و تفصيل-8 معربا عن mCherry::histone H2B (أرجواني). وتشير رؤوس الأسهم إلى لوحظت أنوكلياتي. هو مقياس بار 2 ميكرومتر. (د) Spermatocytes تمر الفرقة الثانية (الناشئين) في نوع البرية والمسخ rec-8 . Spermatocytes نوع البرية الخضوع متماثل الشعب أسفر عن أربعة مهدها لوحظت، كل منهما مكملاً كروموسوم فرداني. في تفصيل-8 spermatocytes متحولة، هو ضعف العزل الصبغي في القسم الثاني. في أغلب الأحيان يبقى كتلة واحدة من الكروماتين في الجسم المتبقية (الميزانية العادية) أو في أحد البلدين الشقيقين لوحظت في الشعبة هو الثاني. وهذا يؤدي إلى أنوكلياتي 8 تفصيل متحولة الحيوانات المنوية (المشار إليها بواسطة رؤوس الأسهم) أو الحيوانات المنوية مثنوية. (ﻫ) صوراً حية من بعد والناشىء لوحظت في نوع البرية وطفرات 8 تفصيل تصور استخدام التدخل التفاضلية التباين (DIC) والفحص المجهري الأسفار. وقد لوحظت نوع البرية جميع مماثلة تشروماتيد الجماهير. 8 تفصيل متحولة لوحظت تشكل الحيوانات المنوية أنوكلياتي. (و) التحديد الكمي للحيوانات المنوية أنوكلياتي متحولة نوع البرية و تفصيل-8 . إنتاج طفرات 8 تفصيل 38.5 في المائة من الحيوانات المنوية أنوكلياتي مقارنة بأقل من 1.6% في نوع البرية. اختبار فيشر الدقيق يشير إلى أن متحولة rec-8 حالات أعلى بكثير من أنوكلياتي الحيوانات المنوية (ف ≤0.0001) مقارنة بنوع البرية. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 2: نظام لتوليد وعزل tetraploid C. ايليجانس من أي سلالة. السهم على اليسار يمثل الجدول الزمني للبروتوكول بدءاً من يوم 1 وتتقدم إلى 17 يوما. يمكن تحقيق نتائج مماثلة من المنحرفين معبر للذكور غير المعالجة في يوم 9. الاتصال بين قوسين تصوير خطوة إلى المخطط الزمني. الحيوانات غير المعالجة باللون البرتقالي، الحيوانات المعالجة الأحمر، الحيوانات الطول تكون أكبر في الحجم، ويصور دسرنا rec-8 معربا عن البكتيريا كما مبين لوحات شفافة مع خلفية حمراء شفافة ومنتظمة OP50 البكتيريا في رمادية شفافة لوحات خلفية. ويتم إجراء عند 15 درجة مئوية ما لم يذكر خلاف ذلك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- رقم 3: أمثلة Tetraploid. (أ) صورة الحقل مشرق حيوان (MSC2) تيترابلويد وسلالة ضعفاني أنها مستمدة من (AV740). تيترابلويد C. ايليجانس هي عموما أكبر وأطول (الطول) من النباتات. النتائج في منحنى جيبية إضافية لجسم تيترابلويد تتحرك هذه الفرق في حجم الجسم ويمكن استخدامها كمعيار للشاشة لمشتقات تيترابلويد. هو مقياس بار Fluorescence الصور 0.1 مم. (ب، ج) مثنوية (AV740) والأكثر نضجاً (MSC1) تيترابلويد البويضات المخصبة نولسي، قبل الشعب هو. ويقوم بمراقبة عدد أزواج الكروموسومات في بويضات المخصبة السلالات الطول المتبعة، كما هو مبين في الفيلم 1 لسلالة MSC1 الإعراب عن Mcherry::H2B و GFP::β-Tubulin في germline الفرز الثانوي. هو مقياس بار 5 ميكرومتر. (د) صور من الفاصل الزمني (2 فيلم) البويضيه tetraploid الشعب هو تصور الانقسام عادي عموما. علامة السهم رؤساء الهيئات القطبية وخط منقط يمثل قشرة البويضات داخل سبيرماثيكا ومحاط بالحيوانات المنوية؛ t = الزمن انقضت في دقائق. شريط مقياس هو 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- النمط الوراثي مشتقات تيترابلويد(مجموعات من أوتوسوميس: # إكستشروموسوميس) * السلالة الأبوية(مثنوية) meIs16 [1p::mCherry دائري:: صاحب 58 + unc-119(+)]؛ MSC1 (4A:4 س) MSC0 ruIs57 [دائري-1p::GFP::ب-توبولين + unc-119(+)] MSC2 (4A:3 س) MSC3 (4A:4 س) MSC5 (4A:3 س) MSC6 (4A:4 س) MSC8 (4A:4 س) unc-119(ed3) الثالث؛ ddIs6؛ ddIs6 [تبج-1::GFP + unc-119(+)]؛ ltIs37؛ ltIs37 [pAA64؛ الدائري-1p::mCherry::HIS-58 + unc-119(+)] الرابع MSC14 (4A:3 س) TMR17 MSC15 (4A:3 س) MSC16 (4A:4 س) مكتب التخطيط الاستراتيجي-11 (me44)/nT1 الرابع؛ + nT1 [qIs51 [بيس ميو-2::gfp-10::gfp، PF22B7.9::gfp]] الخامس AV800& AV776 meIs8 [دائري-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] الثاني؛ AV809& AV727 ltIs37 [1p::mCherry دائري:: صاحب 58 + unc-119(+)] رابعا؛ ltIs38 [pie-1p::gfp::ph(PLC1delta1) + unc-119(+)] meIs8 [دائري-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] الثاني؛ mnT12 (س؛ رابعا) AV826& AV695 mIn1 [dpy-10(e128) mIs14 [ميو-2::gfp pes-10::gfp]/ AV810& DR2078 bli-2(e768) unc-4(e120) الثاني
 ruIs32 [دائري-1::GFP::H2B + unc-119(+)] ثالثا
 AV822& AZ212 AV823& جيم-برجس-mfIs42 [سل-سيد-2 + Cel-ميو-2::DsRed] AV824& JU1018 الجدول 1: سلالات Tetraploid المتولدة. * الاستدلال بتسجيله عدد بيفالينتس (أزواج مثلى متصل) وأونيفالينتس (homologs الفردية) في بويضات قبل الشعب هو بالإضافة إلى أن نسبة الذكور أنجب. الفيلم 1: فحص تأكيد ما إذا كانت مستقرة الطول سلالات من كامل أو جزئي تيترابلويدس. يبدأ الفيلم مع رسم تخطيطي خنثي البرية نوع تسليط الضوء على المنطقة المصورة (بويضات المخصبة) لتحديد تيترابلويدس عن طريق العد أزواج الكروموسومات. بعد الرسم التخطيطي، سلسلة من الأفلام Z-المكدس وإسقاطات إظهار الغدد التناسلية حيوانات مثنوية و tetraploid الثابتة و DAPI الملون أو يعيش صور لسلالات معربا عن هيستون Mcherry::H2B. ويتم الفرز بإحصاء عدد أزواج الكروموسومات المتجانسة متصلة في بويضات المخصبة. عد مشري أو DAPI يتم الهيئات الملون في البويضات المخصبة الأقرب إلى الحيوانات المنوية تخزين سبيرماثيكا (“البويضيه-1”). الكروموسومات في هذه البويضات الأكثر مكثف وفصلها عن بعضها البعض، السماح لأزواج homolog أكثر دقة التهم الموجهة إليه. تم فحص أكثر من 10 الحيوانات كل سلالة للتأكد من التهم كروموسوم البويضيه-1 دقيقة. سمك المكدس 0.2 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.) الفيلم 2: الانقسامات البويضيه Tetraploid تبدو طبيعية. الفاصل الزمني لتقسيم البويضيه سلالة tetraploid معربا عن هيستون Mcherry::H2B و GFP::β-Tubulin. توقيت ونمط من الانقسامات التي تبدو طبيعية. الصور التي التقطت كل دقيقة 2.5 من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Discussion

إنتاج الأمشاج فرداني (ن) مفتاح توليد اقحه ضعفاني (2n) في التسميد. يتم إنجاز هذا التخفيض للجينوم أثناء الانقسام الاختزالي مع الشعبتين الخلية على التوالي بعد تكرار جينوم واحد. لتوليد فرداني الأمشاج, C. ايليجانس، كما هو الحال مع معظم ميتازوانس الأخرى، تفصل بين الأمهات وباتيرنالي-المشتقة من هومولوجس في الدرجة الأولى، بينما الأخت شقاً الصبغي من هومولوج كل فصل في القسم الثاني. واحدة طريقة أن الجينوم كامل بوليبلويدي تنشأ في الطبيعة من خلال توليد الأمشاج التي تفشل إلى نصف حجمها الجينوم أثناء الانقسام الاختزالي.

أنه كان معروفا منذ أكثر من 50 عاماً أن tetraploid C. ايليجانس الخيطية صالحة وخصبة. نيجون23، ولاحق مادل وهيرمان22، التي تم إنشاؤها وتحديد عدد قليل من تيترابلويدس C. ايليجانس بتعطيل الكروموسوم هو الفصل بين استخدام العلاجات صدمة الحرارة واستخدام الواسمات الوراثية، على التوالي. واحدة إضافية استمدت سلالة تيترابلويد برجس جيم- استخدام هذا البروتوكول أكثر من 30 سنة لاحقة24. واستخدمت هذه تيترابلويدس للتحقيق في كيفية تحديد ما إذا كان ينبغي أن تصبح الذكور أو خنثي، كيف ploidy ينظم نمو وحجم، وتحليل الأقران وتشابك في الانقسام الاختزالي25،26، C. ايليجانس 38 , 39 , 40-بعد هذه وغيرها من الدراسات التي تتطلب استخدام تيترابلويدس محددة أو سلالات الكروموزومية كانت محدودة بسبب الصعوبة في توليد سلالات تيترابلويد بهذا الأسلوب.

البروتوكول هو موضح هنا يتيح توليد 4A كامل مستقر، 4 X وجزئية 4A، 3 X tetraploid كاينورهابديتيس السلكية سلالات من أي الأولية مثنوية الخلفية الجينية أو تناذر دون استخدام البصمات الجينية.

وقد تنشأ تيترابلويدي بأكثر من “إليه واحدة” في C. ايليجانس:

واقترح مادل وهيرمان أن سلالات tetraploid أنها ولدت المرجح المستمدة من دولة وسيطة الكروموزومية. تم الحصول على سلالات بهم عن طريق التحديد على مدى أجيال متعددة، أو طريق عبور الكروموزومية المفترضة المتوسطة مع الذكور مثنوية22. العيوب في الكروموسومات التقسيم في طفرات rec-8 أن يثير بويضات النباتات والحيوانات المنوية توحي إليه أخرى المحتملة التي قد تنشأ الحيوانات tetraploid مع تفصيل-8 [رني] مخطط27.

يمكن أن تنتج المنحرفين [رني] يعامل rec-8 بويضات مثنوية و spermatocytes، مما سيؤدي إلى tetraploid الحيوانات عند الإخصاب. يتفق مع هذا الاحتمال حقيقة أن بعض المنحرفين F2 المستنسخة تثير ثابتة الطول سلالات في الجيل المقبل، مما يوحي بأن المنحرفين F2 الطول المستنسخة حيث الفعل tetraploid. ويعبر الجيل الأول من التوصية 8 [رني] معاملة المنحرفين في نظام العبور، مع الذكور غير المعالجة. لا يزال يمكن أن تنشأ spermatocytes مثنوية في الذكور لأن الصليب ويتم حضور البكتيريا معربا عن دسرنا rec-8 وهكذا، يتعرض الذكور إلى تفصيل-8 [رني] أثناء التزاوج لمدة 3 أيام على الأقل. ولذلك، يمكن أيضا قد شكلت polyploids الطول في مخطط كروسفيرتيليزينج من إخصاب بويضات مثنوية بالحيوانات المنوية مثنوية. قد تنشأ سلالات tetraploid مستقرة من الإخصاب أما بين الأمشاج ضعفاني أو من عبور الكروموزومية الحيوانات التي تحتوي على بويضات للمتغير بلويدي مع الحيوانات النباتات المنتجة للحيوانات المنوية فرداني.

اعتبارات هامة:

المتمتعة بالحكم الذاتي-مقابل مخططات الإثراء المتبادل:

مخطط التسميد الذاتي rec-8 [رني] معاملة المنحرفين F1، والخطة المتعلقة بعبور المنحرفين تعامل مع الذكور غير المعالجة على حد سواء قد أثارت 4A، 4 X و 4A، 3 X سلالات تيترابلويد. على الرغم من أن بوليبلويدس أكثر كانت معزولة في البداية من مخطط تخصيب ذاتي، أكثر من هذه الحيوانات الكروموزومية العقيمة وهكذا كلا مخططات تتسم بالكفاءة وبالمثل في إنتاج سلالات مستقرة tetraploid. السبب في زيادة النجاح والعقم في خطة تخصيب ذاتي لا يزال غير معروف. على الرغم من أن كلا أنظمة تتسم بالكفاءة وبالمثل، أسهل برنامج تخصيب ذاتي كما أنها لا تتطلب عزل الذكور للتزاوج. وبالإضافة إلى ذلك، عندما سلالة الاهتمام عدم كفاءة أو عيب في التزاوج، يفضل النظام الذاتي صنع الأسمدة. يمكن استخدام مخطط كروسفيرتيليزينج لتوليد تيترابلويدس المعقدة التي تحتوي على أكثر من نسختين من الكروموسوم واحد.

التعديلات والقيود:

حاليا، يتضمن هذا البروتوكول rec-8 [رني] العلاج بتغذية البكتيريا معربا عن دسرنا للجينات rec-8 . وبالتالي، لا يعمل هذا البروتوكول في الأنواع كاينورهابديتيس لا يستجيب إلى [رني] التغذية، أو طفرات معيبة في انتشار [رني] البيئية أو النظمية بين الأنسجة41،،من4243. يمكن أن يحتمل أن حل هذه المشكلة بإدخال العلاج [رني] عن طريق الحقن المباشر دسرنا لمصلحة مباشرة الخط.

يجب أن يتم إنشاء الحيوانات الكروموزومية طريق عبور tetraploid لحيوان ضعفاني أنها مستمدة من خلالها، لأن هذا النظام لا تولد سلالات الكروموزومية مستقرة44،45. 15% فقط من البيض أنجب بالكروموسومات هاتش، وذرياتهم معظمهم ذرية عقيمة بسبب انيوبلويدي. وبالإضافة إلى ذلك، تميل ذرية خصبة الباقين على قيد الحياة قليلة أن تكون كاملة أو بالقرب من ديبلويدس في غضون بضعة أجيال. هذا المرجح، جزئيا على الأقل، لأن بويضات جزئيا تصحيح تريسمي بفصل الكروموسوم الثالث في الجسم القطبي في الشعبة هو الأول.

حد لا يمكن التغلب عليها من هذا البروتوكول هو أنها لا تعمل لجعل تيترابلويدس طفرات التي تؤثر على مكونات الجهاز [رني] لأنها مقاومة ل العلاج [رني]46.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها:

8-تفصيل [رني]:

بعض الاعتبارات ذات أهمية حاسمة لهذا البروتوكول أن تكون ناجحة. الأول استخدام إيبتج الطازجة وتقدم طازجة نمج إيبتج لوحات لتحريض إنتاج دسرنا rec-8 في البكتيريا البكتيريا HT115 تحمل استنساخ rec-8 (W02A2.6). إيبتج حساسة للضوء، وأنه من المهم للحد من التعرض للضوء على لوحات. يمكن تخزين لوحات إيبتج إلى شهر واحد في 4 درجات مئوية في الظلام. ثانيا، تفصيل-8 (W02A2.6) [رني] HT115 السلالات البكتيرية من مكتبة أهرينجير (كاماث وأهرينجير 2003) أثمر النمط الظاهري 8 تفصيل أقوى من الأخرى المتاحة 8 تفصيل استنساخ HT115.

سلالة تيترابلويد الصيانة:

سلالات تيترابلويد تنمو ببطء شديد، وتنتج أكثر من 50 نسلها كل جيل47. جميع سلالات تيترابلويد التي تم تحديدها مستقرة نسبيا، ولكنها يمكن أن كسر وتصبح مثنوية عندما أكد (هودجكن جوناثان الاتصال الشخصي وملاحظاتنا غير منشورة). ولذلك، من المهم أن نلاحظ أنه عندما تزرع سلالات تيترابلويد في 25 درجة مئوية والحرارة-الصدمة، جوعاً، أو المجمدة ومطلق، سرعة الرجوع إلى ديبلويدي، ولذلك فمن المهم الاستمرار في انتقاء الحيوانات الطول عند إزالة الجليد هذه السلالات أو عند تعريض هذه السلالات للظروف المجهدة التي قد تسبب لهم بالعودة.

التطبيقات الممكنة:

استقصاء الأثر أو دور بوليبلويديزيشن الجينوم كله في تطور ودورة الخلية، والتعبير الجيني، والتنمية في الكائنات الحية متعددة الخلايا تعتمد على المقارنات بين: الخلايا في الكائن حي التي تحتوي على مختلف ploidy، نفس الخلية أنواع في وثيقة الصلة من الأنواع المختلفة من بلويدي، أو الأنواع التي شهدت الأحداث بوليبلويديزيشن الأخيرة تقحم والعزلة المادية3،5،،من67،8 11، ،،من1820،19،48،،من4950. على الرغم من أن تيترابلويدس يمكن أن يستمد من نظم نموذجية الزرد، والماوس، يتم ذرياتهم العقيمة أو شأن قاتلة16،17. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الأنظمة النموذجية لها دورات حياة طويلة بالمقارنة مع C. ايليجانس، والأساليب المتاحة لتوليد الحيوانات الكروموزومية معقدة وغير فعالة. ولذلك، سلالات C. ايليجانس المستمدة بهذه الطريقة ستكون مفيدة لتعزيز أي التحقيق في الآثار والأدوار للجينوم كله بوليبلويدي في الكائنات متعددة الخلايا.

منذ الكروموزومية يمكن أن يستمد من تيترابلويد طريق عبور tetraploid للنباتات الأصلية، مقارنة بين ديبلويدس والكروموسومات تيترابلويدس التي تختلف فقط في عدد النسخ الجينوم، يوفر فرصة فريدة من نوعها ولم يسبق لها مثيل إلى تقييم ما يعادل الحيوانات/أجهزة/الخلايا مع حجم الجينوم مختلفة (أو الجينات الجرعة). المرونة وسهولة المخطط الموضح هنا أتاح لنا أن تولد العشرات من سلالات تيترابلويد من مختلف الخلفيات مثنوية الوراثية أو كاريوتيبيس. بعض من هذه السلالات استخدمت بالفعل لآليات الاستعلام زوج الكروموسوم مثلى وتشابك أثناء الانقسام الاختزالي27.

نوع البرية والمسخ سلالات tetraploid تحمل علامات مضيئة سوف توفر سبلاً جديدة للتحقيق لفهم العلاقات بين نسبة الحجم والنووية/سيتوسول المجين على الحيوان داخل الخلايا/الخلوي/الجهاز وكله التحجيم، الجينوم كله بوليبلويديزيشن على التكيف وانتواع والجرعة الجينات والتعبير وتطوير الجهاز والأنسجة. بالإضافة إلى دراسة القياس البيولوجي، توليد سلالات tetraploid ستعزز إلى حد كبير استعلامات مسائل البيولوجية الأساسية ذات الصلة إلى خارج الخلية إشارات، من عدم الاستقرار الجينوم، اندوريدوبليكيشن، والجينوم كله الازدواجية، والجرعة الجينات، والتكيف مع التشديد، تطور المقاومة للعقاقير، وانتواع إليه.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونشكر مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس (بتمويل من المعهد الوطني للصحة (NIH) مكتب للبحوث البنية التحتية البرامج P40 OD010440) على السلالات. الكتاب يود أن يشكر بابتيست رولينس وايلي ليسمان، لتزويدنا بالملاحظات البناءة و “مختبر مانو” في حقائق عجيبة، جامعة مدينة نيويورك لاستخدام تلك المختبرات لجزء من تصوير وعلى مساعدتهم. أيد هذا العمل على جائزة PSC-جامعة مدينة نيويورك ترادب-46-113 والمعاهد الوطنية للصحة منح 1SC2GM118275-01. ماجستير يدعمه جزئيا المعهد الكندي للصحة (استوفوا) زمالات ما بعد الدكتوراه، وأيده خلفا المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس “ارتفاع” منح GM062981.

Materials

Dissecting Microscope Motic Microscopy SMZ171
Name Company Catalog Number Comments
NGM agar plates
60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile Tritech Research T3305
35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile Tritech Research T3500
Bacteriological Agar, 5 kg VWR 89140-850
Sodium Chloride, Biotechnology Grade VWR 97061-278
Peptone, BD Bacto VWR 90000-368
Ampicillin Trihydrate VWR 97062-300
IPTG, dioxane-free Thermo Scientific R0391
Name Company Catalog Number Comments
Growth Culture
LB Lennox Broth IBI Scientific 89126-176
Name Company Catalog Number Comments
LB Agar plates
LB Agar Lennox IBI Scientific 89126-182
Name Company Catalog Number Comments
Antibiotics
Ampicillin Trihydrate VWR 97062-300
Tetracycline Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Name Company Catalog Number Comments
Staining
Hoechst 33258, Pentahydrate Biotium 40045
DAPI Biotium 40011
Name Company Catalog Number Comments
Ethanol Fixation
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP Koptec, VWR 89125-166
Name Company Catalog Number Comments
M9 Buffer
Sodium chloride, Biotechnology Grade VWR 97061-278
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade VWR 97062-346
Sodium phosphate, monobasic dihydrate Fisher Scientific AC271750025
Name Company Catalog Number Comments
RNAi Clones
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA Source Bioscience W02A2.6
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA Dharmacon RCE1182-202299820
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Ricke, R. M., van Ree, J. H., van Deursen, J. M. Whole chromosome instability and cancer: a complex relationship. Trends Genet. 24, 457-466 (2008).
  2. Frawley, L. E., Orr-Weaver, T. L. Polyploidy. Curr Biol. 25, R353-R358 (2015).
  3. Orr-Weaver, T. L. When bigger is better: the role of polyploidy in organogenesis. Trends Genet. 31, 307-315 (2015).
  4. Otto, S. P. The evolutionary consequences of polyploidy. Cell. 131, 452-462 (2007).
  5. Davoli, T., de Lange, T. The Causes and Consequences of Polyploidy in Normal Development and Cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
  6. Adams, K., Wendel, J. Novel patterns of gene expression in polyploid plants. Trends Genet. 21, 539-543 (2005).
  7. Adams, K. L., Wendel, J. F. Polyploidy and genome evolution in plants. Curr Opin Plant Biol. 8, 135-141 (2005).
  8. Berman, J. Ploidy plasticity: a rapid and reversible strategy for adaptation to stress. FEMS Yeast Res. 16, (2016).
  9. Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of Intracellular Scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
  10. Breneman, A., Cande, J., Dunn, J., Burbank, K., O’toole, E. Genome-wide genetic analysis of polyploidy in yeast. Nature. 443, 541-547 (2006).
  11. Kuznetsova, A. Y., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell Cycle. 14, 2810-2820 (2015).
  12. Taylor, J. S., Van de Peer, Y., Meyer, A. Genome duplication, divergent resolution and speciation. Trends Genet. 17, 299-301 (2001).
  13. Younis, A., Hwang, Y. -. J., Lim, K. -. B. Exploitation of induced 2n-gametes for plant breeding. Plant Cell Rep. 33, 215-223 (2014).
  14. Ihssen, P. E., McKay, L. R., McMillan, I., Phillips, R. B. Ploidy Manipulation and Gynogenesis in Fishes: Cytogenetic and Fisheries Applications. Trans Am Fish Soc. 119, 698-717 (2011).
  15. Stanley, J. G., Allen, S. K., Hidu, H. Polyploidy induced in the American oyster, Crassostrea virginica, with cytochalasin B. Aquaculture. 23, 1-10 (1981).
  16. Eakin, G. S., Behringer, R. R. Tetraploid development in the mouse. Dev Dyn. 228, 751-766 (2003).
  17. Heier, J., Takle, K. A., Hasley, A. O., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate cleavage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
  18. Arnold, B., Kim, S. -. T., Bomblies, K. Single Geographic Origin of a Widespread Autotetraploid Arabidopsis arenosa Lineage Followed by Interploidy Admixture. Mol Biol Evol. 32, 1382-1395 (2015).
  19. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538, 336-343 (2016).
  20. Gallardo, M. H., Bickham, J. W., Honeycutt, R. L., Ojeda, R. A., Köhler, N. Discovery of tetraploidy in a mammal. Nature. 401, 341 (1999).
  21. Hodgkin, J. Primary sex determination in the nematode C. elegans. Development. 101, 5-16 (1987).
  22. Madl, J. E., Herman, R. K. Polyploids and sex determination in Caenorhabditis elegans. Genetica. 93, 393-402 (1979).
  23. Nigon, V. Polyploidie experimentale chez un nematode libre, Rhabditis elegans maupas. Bull Biol Fr Belg. 95, 187-225 (1951).
  24. Woodruff, G. C., Eke, O., Baird, S. E., Félix, M. -. A., Haag, E. S. Insights Into Species Divergence and the Evolution of Hermaphroditism From Fertile Interspecies Hybrids of Caenorhabditis Nematodes. Genetica. 186, 997-1012 (2010).
  25. Mlynarczyk-Evans, S., Roelens, B., Villeneuve, A. M. Evidence That Masking of Synapsis Imperfections Counterbalances Quality Control to Promote Efficient Meiosis. PLoS Genet. 9, e1003963 (2013).
  26. Lozano, E., Sáez, A. G., Flemming, A. J., Cunha, A., Leroi, A. M. Regulation of Growth by Ploidy in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 16, 493-498 (2006).
  27. Roelens, B., Schvarzstein, M., Villeneuve, A. M. Manipulation of Karyotype in Caenorhabditis elegans Reveals Multiple Inputs Driving Pairwise Chromosome Synapsis During Meiosis. Genetica. 201, 1363-1379 (2015).
  28. Martinez-Perez, E., et al. Crossovers trigger a remodeling of meiotic chromosome axis composition that is linked to two-step loss of sister chromatid cohesion. Genes Dev. 22, 2886-2901 (2008).
  29. Severson, A. F., Ling, L., van Zuylen, V., Meyer, B. J. The axial element protein HTP-3 promotes cohesin loading and meiotic axis assembly in C. elegans to implement the meiotic program of chromosome segregation. Genes Dev. 23, 1763-1778 (2009).
  30. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
  31. Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis Elegans. , (1988).
  32. MacQueen, A. J., et al. Chromosome Sites Play Dual Roles to Establish Homologous Synapsis during Meiosis in C. elegans. Cell. 123, 1037-1050 (2005).
  33. Martinez-Perez, E., et al. Crossovers trigger a remodeling of meiotic chromosome axis composition that is linked to two-step loss of sister chromatid cohesion. Genes Dev. 22, 2886-2901 (2008).
  34. Schvarzstein, M., Wignall, S. M., Villeneuve, A. M. Coordinating cohesion, co-orientation, and congression during meiosis: lessons from holocentric chromosomes. Genes Dev. 24, 219-228 (2010).
  35. Kim, S., Spike, C., Greenstein, D. . Germ Cell Development in C. elegans. , 277-320 (2013).
  36. Peters, N., et al. Control of mitotic and meiotic centriole duplication by the Plk4-related kinase ZYG-1. J Cell Sci. 123, 795-805 (2010).
  37. Pasierbek, P. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes Dev. 15, 1349-1360 (2001).
  38. Hodgkin, J. Primary sex determination in the nematode C. elegans. Development. 101, 5-16 (1987).
  39. Flemming, A. J., Shen, Z. -. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 5285-5290 (2000).
  40. Meneely, P. M. Sex determination in polyploids of Caenorhabditis elegans. Genetica. 137, 467-481 (1994).
  41. Whangbo, J. S., Hunter, C. P. Environmental RNA interference. Trends Genet. 24, 297-305 (2008).
  42. Imae, R., Dejima, K., Kage-Nakadai, E., Arai, H., Mitani, S. Endomembrane-associated RSD-3 is important for RNAi induced by extracellular silencing RNA in both somatic and germ cells of Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 28198 (2016).
  43. Tijsterman, M., May, R. C., Simmer, F., Okihara, K. L., Plasterk, R. H. A. Genes required for systemic RNA interference in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 14, 111-116 (2004).
  44. Cortes, D. B., McNally, K. L., Mains, P. E., McNally, F. J. The asymmetry of female meiosis reduces the frequency of inheritance of unpaired chromosomes. Elife. 4, e06056 (2015).
  45. Vargas, E., et al. Autosomal Trisomy and Triploidy Are Corrected During Female Meiosis in Caenorhabditis elegans. Genetica. 207, 911-922 (2017).
  46. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
  47. Hodgkin, J. . Karyotype, ploidy, and gene dosage. , (2005).
  48. Schoenfelder, K. P., Fox, D. T. The expanding implications of polyploidy. J Cell Biol. 209, 485-491 (2015).
  49. Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8, a019166 (2015).
  50. Taylor, J. S., Van de Peer, Y., Braasch, I., Meyer, A. Comparative genomics provides evidence for an ancient genome duplication event in fish. Philos Trans Royal Soc B. 356, 1661-1679 (2001).

Tags

TetraploidPloidyCaenorhabditis ElegansRec-8RNAiPolyploidizationGene DosageGenome InstabilitySpeciationDiploidSpermatocytesOocytesE. ColiIPTGAmpicillinLBHermaphroditesL4 Stage

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Clarke, E. K., Rivera Gomez, K. A., Mustachi, Z., Murph, M. C., Schvarzstein, M. Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (133), e57296, doi:10.3791/57296 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image