यह आलेख वर्णन करता है कि उपकरणों (EcoFABs) के पारिस्थितिकी तंत्र निर्माण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल है कि पौधों और संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत के उच्च नियंत्रित प्रयोगशाला स्थितियों में के अध्ययन को सक्षम करें ।
लाभकारी संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत की क्षमता कम इनपुट खाद्य और जैव ऊर्जा के उत्पादन को बढ़ावा देने के साथ एक स्थाई जैविक समाधान प्रदान करते हैं । इन जटिल संयंत्र के एक बेहतर यंत्रवत समझ-सूक्ष्म जीव बातचीत संयंत्र उत्पादन में सुधार के साथ ही बुनियादी पारिस्थितिकी संयंत्र की जांच अध्ययन-मिट्टी-सूक्ष्म जीव बातचीत करने के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा । यहां, पारिस्थितिकी तंत्र निर्माण के लिए एक विस्तृत वर्णन प्रस्तुत किया है, व्यापक रूप से उपलब्ध 3 डी मुद्रण प्रौद्योगिकियों का उपयोग कर, संयंत्र के यंत्रवत अध्ययन के लिए नियंत्रित प्रयोगशाला निवास (EcoFABs) बनाने के लिए-विशिष्ट पर्यावरण के भीतर सूक्ष्म जीव बातचीत शर्तों. EcoFABs के दो आकारों में वर्णित है कि विभिंन प्रजातियों के पौधे के साथ माइक्रोबियल बातचीत की जांच के लिए अनुकूल है, Arabidopsis थालियाना, Brachypodium distachyon, और Panicum virgatumसहित । इन उपकरणों के माध्यम से प्रवाह नियंत्रित हेरफेर और रूट microbiomes, रूट रसायन विज्ञान के साथ ही रूट आकृति विज्ञान और माइक्रोबियल स्थानीयकरण की इमेजिंग के नमूने के लिए अनुमति देते हैं । इस प्रोटोकॉल EcoFABs अंदर बाँझ शर्तों को बनाए रखने और EcoFABs पर स्वतंत्र एलईडी लाइट सिस्टम बढ़ते के लिए विवरण शामिल हैं । मिट्टी, रेत सहित मीडिया के विभिंन रूपों के अलावा के लिए विस्तृत तरीकों, और तरल विकास इमेजिंग और metabolomics का उपयोग कर इन प्रणालियों के लक्षण वर्णन करने के लिए मिलकर मीडिया में वर्णित हैं । एक साथ, इन प्रणालियों microbiome संरचना (म्यूटेंट सहित) के हेरफेर सहित संयंत्र और संयंत्र-माइक्रोबियल consortia की गतिशील और विस्तृत जांच सक्षम, संयंत्र विकास की निगरानी, रूट आकृति विज्ञान, रिसाव संरचना, और नियंत्रित पर्यावरणीय परिस्थितियों में माइक्रोबियल स्थानीयकरण । हमें आशा है कि इन विस्तृत प्रोटोकॉल अंय शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा करेंगे, आदर्श संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत की जांच के लिए मानकीकृत प्रयोगात्मक प्रणाली बनाने में मदद ।
कृषि में लाभकारी संयंत्र रोगाणुओं के आवेदन टिकाऊ खाद्य और जैव ईंधन उत्पादन बढ़ाने के लिए एक बढ़ती हुई जनसंख्या1,2,3,4के लिए प्रदान करने के लिए महान क्षमता प्रदान करता है । काम की एक महत्वपूर्ण राशि संयंत्र पोषक तत्व में microbiomes के महत्व का समर्थन करता है, तनाव को सहिष्णुता, और रोग के लिए प्रतिरोध5,6,7,8। हालांकि, यह संयंत्र के इन तंत्र-जटिलता और जुड़े irreproducibility और ठीक microbiome संरचना और आनुवंशिकी नियंत्रण करने के लिए अक्षमता के कारण क्षेत्र पारिस्थितिकी प्रणालियों में सूक्ष्म जीव बातचीत की जांच करने के लिए मुश्किल है (उदा, का उपयोग कर माइक्रोबियल म्यूटेंट)4,9,10।
एक रणनीति को सरलीकृत मॉडल पारिस्थितिकी प्रणालियों के निर्माण के लिए नियंत्रित, दोहराया प्रयोगशाला प्रयोगों संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत की जांच के लिए अंतर्दृष्टि है कि आगे के क्षेत्र में परीक्षण किया जा सकता है उत्पंन 10, 11, 12. इस अवधारणा को मिट्टी से भरे बर्तन में या ग्रीनहाउस या मशीनी13के भीतर स्लैब पर हो पौधों का उपयोग पारंपरिक दृष्टिकोण पर बनाता है । हालांकि इन की संभावना सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण रहेगा, वे ठीक से निगरानी और संयंत्र विकास के वातावरण में हेरफेर करने की क्षमता की कमी होगी । इन समाप्त करने के लिए, rhizoboxes और rhizotrons नीचे अध्ययन करने की क्षमता में एक बड़े सुधार का प्रतिनिधित्व करते हैं-जमीन प्रक्रियाओं14,15, और, पहले प्रोटोकॉल16मिट्टी में rhizosphere चयापचयों का विश्लेषण करने के लिए प्रकाशित किया गया । हाल ही में, उच्च प्रवाह विश्लेषण को सक्षम करने के लिए, उंनत microfluidic उपकरणों13,17 जैसे संयंत्र चिप18,19, RootArray20, और RootChip21, गया है तरल प्रवाह माध्यम में छोटे मॉडल संयंत्र Arabidopsis थालियाना के प्रारंभिक विकास चरणों पर नजर रखने के लिए माइक्रोमीटर पैमाने स्थानिक संकल्प के साथ संयंत्र phenotyping के लिए कुशल उपकरण के रूप में विकसित की है । हाल ही में, एक दो परत इमेजिंग मंच है कि एक microfluidic मंच22के साथ अंकुर चरण में Arabidopsis थालियाना के रूट हेयर इमेजिंग सक्षम बनाता है वर्णन किया गया था ।
यहां, नियंत्रित प्रयोगशाला उपकरणों के निर्माण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल (EcoFABs), संयंत्र सूक्ष्म जीव बातचीत का अध्ययन करने के लिए प्रदान की जाती है और पता चलता है कि वे Arabidopsisथालियाना सहित विविध पौधों का अध्ययन किया जा सकता है, Brachypodium distachyon23, पारिस्थितिकी रूप से महत्वपूर्ण जंगली जई Avena बरबटा, और के रूप में Panicum virgatum (switchgrass) । EcoFAB डिवाइस और बाँझ संयंत्र आकार पारदर्शी कंटेनर: EcoFAB एक बाँझ संयंत्र विकास मंच है कि दो प्राथमिक घटक भी शामिल है. EcoFAB डिवाइस एक polydimethylsiloxane (PDMS) विनिर्माण प्रक्रिया है कि एक 3 डी मुद्रित प्लास्टिक मोल्ड से PDMS परतों कास्टिंग शामिल है और सूक्ष्मदर्शी स्लाइड पर PDMS परतों संबंध का उपयोग पहले तरीकों की सूचना दी24,25 . EcoFAB कार्यप्रवाह की विस्तृत प्रक्रियाओं, जैसे डिवाइस निर्माण, नसबंदी, बीज अंकुरण, अंकुर प्रत्यारोपण, सूक्ष्म जीव टीका/cocultivation, नमूना तैयारी, और विश्लेषण, इस प्रोटोकॉल में वर्णित हैं (चित्र1) । इसके अलावा बुनियादी कार्यप्रवाह के संशोधनों का वर्णन किया गया है, सहित कंप्यूटर की स्थापना नियंत्रित एलईडी रोशनी बढ़ती है और ठोस सब्सट्रेट के उपयोग । इमेजिंग तकनीक का उपयोग रूट आकृति विज्ञान परिवर्तन की जांच करने के लिए, जड़ों के माइक्रोबियल औपनिवेशीकरण, और जड़ exudates के मास स्पेक्ट्रोस्कोपी इमेजिंग वर्णित हैं । हमें आशा है कि सरल, सस्ती आसानी से उपलब्ध सामग्री पर आधारित डिजाइन, साथ ही साथ विस्तृत प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत, एक समुदाय संसाधन में EcoFAB मंच बंद हो जाएगा, प्रयोगशाला संयंत्र-microbiome अध्ययन मानकीकरण ।
प्रोटोकॉल EcoFABs बनाने के लिए पारिस्थितिकी तंत्र निर्माण का उपयोग कर के लिए यहां की सूचना दी उच्च नियंत्रित प्रयोगशाला शर्तों में व्यवस्थित संयंत्र जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए समुदाय संसाधन प्रदान करता है । 3d मुद्रण में अग्रिमों के निर्माण और iteratively शोधन EcoFAB डिजाइनों के लिए व्यापक रूप से सुलभ प्रौद्योगिकियों प्रदान करते हैं । रूट चैंबर यहां प्रस्तुत करने के लिए अच्छी तरह से इमेजिंग माइक्रोस्कोपी और बनाए रखने के लिए अनुकूल हो पाया है, रोगाणुओं के नियंत्रण के अलावा सक्षम करने के लिए संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत की जांच । EcoFAB मंच विभिन्न प्रजातियों के पौधे के साथ संगत है । यह संकीर्ण रूट चैंबर के भीतर पौधों को उगाने के शारीरिक प्रभाव को पहचानने के लिए महत्वपूर्ण है कि इस तरह के अतिरिक्त प्रयोगों प्राकृतिक वातावरण में बढ़ पौधों के लिए निष्कर्षों को सामान्य करने के लिए आवश्यक हो जाएगा.
बाँझ मंडलों और एलईडी प्रकाश का उपयोग विभिन्न प्रकाश स्थितियों के प्रभाव की जांच सक्षम बनाता है, तरंग दैर्ध्य सहित, तीव्रता, और अवधि, संयंत्र विकास पर और समानांतर में संबंधित शारीरिक मापदंडों. प्रतिवर्ती बांडिंग रूट चैंबर ठोस सब्सट्रेट के उपयोग के साथ ही स्थानिक जैव रासायनिक और आनुवंशिक विश्लेषण के लिए ठोस नमूने लेने के लिए अनुमति देते हैं । ऐसे मिट्टी, रेत के रूप में ठोस सब्सट्रेट, के आवेदन, और क्वार्ट्ज मोती, अधिक पारिस्थितिकी प्रासंगिक प्रयोगशाला पारिस्थितिकी प्रणालियों का निर्माण करने के लिए EcoFABs का उपयोग करने की संभावनाओं की पेशकश. हालांकि, सभी प्रणालियों यहां प्रस्तुत उपयोग संतृप्त तरल (hydroponic संस्कृतियों) जो सबसे मिट्टी का एक सटीक प्रतिबिंब नहीं है और यह आगे इन डिजाइनों को परिष्कृत करने के लिए मिट्टी के भीतर हवा जेब ऐसी है कि वे बेहतर प्रतिनिधित्व बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण होगा प्राकृतिक मिट्टी ।
दोनों सरल कैमरों और सूक्ष्मदर्शी का उपयोग सेलुलर स्तर के लिए दोनों थोक में छवि जड़ प्रणाली आकृति विज्ञान विकास के लिए वर्णित है । रूट आकृति विज्ञान इमेजिंग और ठहराव की निगरानी के लिए यह उपयुक्तता की संभावना संयंत्र के नियामक तंत्र को समझने के लिए मददगार होगा शारीरिक और आणविक संयंत्र genotypic रूपांतरों द्वारा ट्रिगर विकास की स्थिति के लिए संकेत. हालांकि, शारीरिक जड़ विकास का अध्ययन करने के लिए एक सीमा EcoFAB डिवाइस के वर्तमान क्षैतिज स्थान है । प्राकृतिक वातावरण में, जड़ों gravitropic प्रतिक्रिया जड़ प्रणाली के एक मुख्य रूप से ऊर्ध्वाधर विकास की ओर जाता है । इस प्रकार, क्षैतिज प्रणाली यहां प्रस्तुत की संभावना एक प्राकृतिक वातावरण से कुछ कारकों में अलग है, और रूट चैंबर के कार्यक्षेत्र स्थान के साथ EcoFAB प्रणालियों के निर्माण भविष्य EcoFAB संस्करणों के लिए एक वांछनीय लक्ष्य है । हालांकि वर्तमान EcoFAB उपकरणों क्षैतिज रखा जाता है, विभिन्न स्थितियों में रूट आकृति विज्ञान मापदंडों का विश्लेषण, या रोगाणुओं के जवाब में, संभव है. उच्च संकल्प इमेजिंग एक अलग या समुदायों की जड़ औपनिवेशीकरण गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए लागू किया जा सकता है, जानकारी प्रदान करने के बारे में जो संयंत्र भागों विभिंन पोषक तत्व पर्याप्त और कमी की स्थिति में बृहदांत्र हैं । यह प्रत्याशित है कि इस तरह के अध्ययनों में महत्वपूर्ण नई अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा कैसे संयंत्र microbiomes इकट्ठा कर रहे हैं, और कैसे इन गतिशीलता समय के साथ बदल जाते हैं, उदाहरण के लिए जड़ों के रूप में विकसित ।
Microfluidic उपकरणों बहुत युवा पौधों की इमेजिंग सक्षम है, और आमतौर पर एकत्र चयापचयों की मात्रा LCMS विश्लेषण के लिए पर्याप्त नहीं है । rhizotrons के रूप में मृदा आधारित सिस्टम, रूट आकृति विज्ञान के इमेजिंग की अनुमति दें जब या तो पौधों chemiluminescent निर्माण के साथ बदल रहे हैं (Glo-root) या एनएमआर-आधारित विधियों के साथ33,34. इन प्रणालियों से Metabolite निकालने के नमूनों की बड़ी मात्रा की वजह से समय लगता है । EcoFABs दोनों का एक संयोजन कर रहे हैं: निर्माण microfluidic उपकरणों के समान है । EcoFABs को पुन: पेश करने के लिए सरल और सस्ती डिजाइन किए गए थे, लेकिन चैंबर के आकार को छोटे या बड़े रूट सिस्टम के साथ पौधों को विकसित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है, उनके प्रजनन चरणों तक । रूट आकृति परिवर्तन और जड़ की एक साथ अवलोकन संभव है । प्रणाली बाँझ, विशिष्ट रोगाणुओं के नियंत्रण के अलावा सक्षम है ।
EcoFABs नियंत्रित परिचय और रोगाणुओं और चयापचयों के नमूने को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं । विशेष रूप से, रूट विकास कक्षों से एकत्र नमूनों को सामूहिक स्पेक्ट्रोस्कोपी metabolite रूपरेखा के लिए पर्याप्त पाया जाता है । जन स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग के एकीकरण (जैसे, NIMS तकनीक यहां प्रस्तुत) रूट सिस्टम के metabolite स्थानिक वितरण का अध्ययन के एक गैर विनाशकारी दृष्टिकोण प्रदान करता है । इस तकनीक की संभावना भविष्य स्थिर आइसोटोप पता लगाने और मानचित्रण विशिष्ट चयापचयों36के लिए माइक्रोबियल स्थानीयकरण में सहायक हो जाएगा । हालांकि इस प्रोटोकॉल एकल अलग पर ध्यान केंद्रित किया है, एक ही डिजाइन निश्चित रूप से अधिक जटिल समुदायों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । EcoFABs के भीतर नमूना मात्रा और बायोमास डीएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों, जो निस्र्पक और माइक्रोबियल समुदाय संरचना और जीन अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा के साथ आगे एकीकरण के लिए पर्याप्त से अधिक की संभावना है ।
अंत में, इस प्रोटोकॉल विवरण संयंत्र की जांच के लिए डिज़ाइन किया गया प्रयोगशाला पारिस्थितिकी प्रणालियों के निर्माण-सूक्ष्म जीव बातचीत, सरल और सुलभ तरीकों कि आसानी से लागू किया जा सकता है और आसपास के शोधकर्ताओं द्वारा विस्तारित पर जोर देने के साथ दुनिया. वर्तमान प्रयासों प्रयोगशालाओं और एक तापमान नियंत्रण प्रणाली है कि प्रत्येक EcoFAB स्वतंत्र रूप से नियंत्रित किया जाएगा प्रकाश और तापमान के एकीकरण के बीच reproducibility प्रदर्शन के उद्देश्य से कर रहे हैं । इस प्रणाली के आगे उंनति स्वचालित नमूना और EcoFAB रूट मंडलों के पुनः भरना और EcoFABs के भीतर प्रासंगिक संयंत्र microbiomes स्थापित करने के लिए reproducible प्रोटोकॉल के विकास के एकीकरण होगा ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम के द्वारा समर्थित किया गया था प्रयोगशाला निर्देशित अनुसंधान और विकास (LDRD) लॉरेंस बर्कले राष्ट्रीय प्रयोगशाला के कार्यक्रम के विज्ञान के कार्यालय द्वारा समर्थित, अमेरिका के ऊर्जा विभाग के तहत अनुबंध No. de-AC02-05CH11231 और एक पुरस्कार de-SC0014079 अमेरिका के ऊर्जा विभाग के कार्यालय से UC बर्कले के लिए । आणविक फाउंड्री में काम अमेरिकी ऊर्जा विभाग के अनुबंध सं के तहत समर्थित था । DE-AC02-05CH11231 । हम भी सुजान एम Kosina, कैथरीन Louie, बेंजामिन पी Bowen, और बेंजामिन जे कोल सभी उनकी मदद के लिए लॉरेंस बर्कले नेशनल लेबोरेटरी में धंयवाद ।
3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
Ethanol | VWR | 89125-172 | |
Bleach | |||
Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |