מאמר זה מתאר מפורטת פרוטוקולים עבור ייצור המערכת האקולוגית של התקנים (EcoFABs) המאפשרים את הלימודים של הצמחים והאינטראקציות צמח-חיידק בתנאי מעבדה מבוקרת מאוד.
אינטראקציות צמח מועיל-חיידק להציע פתרון הביולוגי בר קיימא עם פוטנציאל כדי להגביר את ייצור המזון, bioenergy קלט-נמוך. הבנה מכניסטית יותר של אינטראקציות מורכבות צמח-חיידק אלה תהיה מכרעת לשיפור ייצור במפעל כפי אקולוגית כן מבצע basic ללימודי אינטראקציות צמח-אדמת-חיידק החקירה. . הנה, תיאור מפורט של המערכת האקולוגית ייצור מוצג, שימוש נרחב זמין טכנולוגיות הדפסה תלת-ממדית, ליצירת מעבדתית מבוקרת בתי גידול (EcoFABs) ללימודי מכניסטית של אינטראקציות צמח-חיידק בתוך ספציפי סביבתיים תנאים. שתי מידות של EcoFABs מתוארים ומותאם החקירה של חיידקים אינטראקציות עם מיני צמחים שונים, לרבות תודרנית לבנה, עקצר distachyon virgatum ושכנותיה. התקנים אלה זרימה דרך לאפשר עבור מבוקר מניפולציה דגימה של שורש microbiomes, שורש כימיה, כמו גם הדמיה של השורש מורפולוגיה ולוקליזציה מיקרוביאלי. פרוטוקול זה כולל את הפרטים עבור שמירה על תנאים סטריליים בתוך EcoFABs, הרכבה מערכות עצמאיות של אור LED על גבי EcoFABs. שיטות מפורט עבור תוספת של צורות שונות של מדיה, כולל קרקעות, חול, צמיחה נוזל מדיית מצמידים אפיון מערכות אלה באמצעות הדמיה, גליקומיקס מתוארים. יחד, מערכות אלו מאפשרים חקירה דינמי ומפורט של צמח, צמח מיקרוביאליים קונסורציומים כולל המניפולציה של קומפוזיציה microbiome (כולל מוטציות), פיקוח על צימוח, מורפולוגיה שורש, הרכב תפליט, ו לוקליזציה של חיידקים תחת תנאי סביבה מבוקרת. אנו צופים כי פרוטוקולים נתונים היסטוריים אלה ישמש נקודת מוצא חשובה עבור חוקרים אחרים, באופן אידיאלי עוזר ליצור מערכות ניסויות מתוקננת על חקירת אינטראקציות צמח-חיידק.
היישום של הצמח מועיל חיידקים בחקלאות מציע פוטנציאל אדיר להגברת ייצור דלק ביולוגי מאצות לספק עבור גידול האוכלוסייה1,2,3,4ואוכל בר קיימא. כמות משמעותית של עבודת תומך את החשיבות של צמח microbiomes צמח ספיגת התזונתי, עמידות בפני לחצים, עמידות בפני מחלות5,6,7,8. עם זאת, קשה לחקור מנגנונים אלה של אינטראקציות צמח-חיידק ב שדה אקולוגיות בשל המורכבות ואת irreproducibility המשויך ואת חוסר היכולת לשלוט בדיוק microbiome הרכב וגנטיקה (למשל., באמצעות חיידקים מוטנטים)4,9,10.
אסטרטגיה אחת היא לבנות מערכות אקולוגיות דגם פשוטה כדי לאפשר מבוקר, משוכפל שמוכר חוקרים אינטראקציות צמח-חיידק ליצירת התובנות יכול להיבדק עוד יותר שדה10,11, 12. המושג הזה בונה על הגישות המסורתיות בעזרת הצמחים גדלו בעציצים מלא אדמה או על אגר לוחות בתוך חממות או חממות13. למרות אלה יוותר הנפוצים ביותר גישות, הם חסרים את היכולת לפקח במדויק ולטפל סביבות גידול הצמח. הקצוות האלה, rhizoboxes, rhizotrons מייצגים על שיפור משמעותי ביכולת ללמוד תהליכים מתחת לקרקע14,15ו הראשונה הפרוטוקולים פורסמו לניתוח rhizosphere מטבוליטים קרקע16. לאחרונה, כדי לאפשר ניתוח תפוקה גבוהה, microfluidic מתקדמים התקנים13,17 כגון צמח שבב18,19, RootArray20RootChip21, היו פיתח כלי יעיל עבור הצמח phenotyping עם רזולוציה מרחבית בקנה מידה מיקרומטר לעקוב אחר השלבים הראשונים צמיחה של צמח מודל קטן תודרנית לבנה במדיום זרימת הנוזל. לאחרונה, פלטפורמה הדמיה דו שכבתי תוארה המאפשרת הדמיה שורש השיער של תודרנית לבנה בשלב שתיל עם פלטפורמה microfluidic22.
. הנה, פרוטוקולים מפורט עבור בניית מכשירי מעבדה מבוקרת (EcoFABs) ניתנים, לימוד אינטראקציות צמח חיידק ולהראות כי הם יכולים לשמש כדי לחקור מגוון צמחים כולל תודרנית לבנה, עקצר distachyon23, את חשובה מבחינה אקולוגית שועל Avena barbata, ועל היבול bioenergy ושכנותיה virgatum (switchgrass). EcoFAB היא פלטפורמה גידול הצמח עקר הכולל שני מרכיביה העיקריים: EcoFAB ההתקן ואת מיכל שקוף בגודל הצמח סטרילי. EcoFAB המכשיר מורכב מ polydimethylsiloxane (PDMS) תהליך זה כרוך הליהוק PDMS הייצור שכבות של תבנית פלסטיק מודפסים 3D ו מליטה PDMS שכבות על גבי שקופיות מיקרוסקופ בשיטות בעבר דיווחו24,25 . ההליכים מפורט של זרימת עבודה EcoFAB, כגון התקן פבריקציה נוספת, עיקור, נביטת הזרעים, השתלת שתיל, חיידק חיסון/cocultivation, הכנת הדוגמא, ניתוח, מתוארים פרוטוקול זה (איור 1). שינויים ותיקונים נוספים של זרימת העבודה הבסיסית מתוארים, הכוללים התקנת המחשב נשלט LED אורות לבין הניצול של סובסטרטים מוצק. הניצול של הדמיה טכניקות כדי לחקור את השורש מורפולוגיה משתנה, מושבת חיידקים של שורשים, ומתוארות הדמיה ספקטרוסקופיות מסה של השורש exudates. אנו צופים כי העיצוב פשוט, זול המבוסס על חומרים זמינים, כמו גם את הפרוטוקולים מפורט המובאים כאן, תהפוך את הפלטפורמה EcoFAB משאב הקהילה, סטנדרטיזציה במחקרי מעבדה צמח-microbiome.
הפרוטוקולים דיווחו כאן עבור השימוש במערכת האקולוגית פבריקציה נוספת כדי ליצור ש-ecofabs מספק משאבי הקהילה למפעל שיטתית לימודי ביולוגיה תנאי מעבדה מבוקרת מאוד. ההתקדמות הדפסת תלת-ממד מספקים טכנולוגיות נרחב נגיש עבור בניית וכוונון iteratively EcoFAB עיצובים. תא שורש המוצג כאן הוא נמצא כדי להיות גם מתאים הדמיה במיקרוסקופ ושמירה על עקרות, המאפשרים תוספת מבוקרת של חיידקים כדי לחקור אינטראקציות צמח-חיידק. פלטפורמת EcoFAB הוא תואם עם מיני צמחים שונים. חשוב לזהות את ההשפעות הפיזיולוגיות של גידול הצמחים בתוך תא שורש צרים כאלה ניסויים נוספים יידרשו כדי להכליל ממצאים צמחים הגדלים סביבות טבעיות.
השימוש סטרילי והמעברים LED לגדול אור מאפשר החקירה של ההשפעות של תנאי תאורה שונים, כולל אורך גל, עוצמת ומשך, על צימוח ופרמטרים פיזיולוגיים הקשורים במקביל. מליטה הפיך שורש צ’יימברס מאפשר השימוש של סובסטרטים מוצק כמו גם באשר במרחב לאסוף דגימות מוצק לניתוח הביוכימי ותעשיה. היישומים של מצעים מוצק, כגון קרקעות, חול קוורץ חרוזים, מציעים האפשרויות של שימוש EcoFABs כדי לבנות מערכות אקולוגיות מעבדה רלוונטי יותר אקולוגי. עם זאת, כל המערכות המובאת כאן שימוש רווי נוזלים (תרבויות הידרופוני) אשר אינם שיקוף מדויק של רוב קרקעות וזה יהיה חשוב עוד יותר לחדד עיצובים אלה כדי לשמור על כיסי אוויר בתוך האדמה, כך שהם מייצגים טוב יותר קרקעות טבעי.
השימוש של מצלמות פשוטות והן מיקרוסקופים מתואר להתפתחות תמונת מערכת השורשים מורפולוגיה-הן בתפזורת לרמות הסלולר. זו התאמה עבור ניטור שורש מורפולוגיה הדמיה וכימות צפוי להיות מועיל להבנת מנגנוני הרגולציה של הצמח אותות פיזיולוגיים ומולקולרית מופעלות על ידי צמח adaptions genotypic על תנאי הגידול. אולם, מגבלה לימוד והתפתחות פיזיולוגית השורש הוא המיקום האופקי הנוכחי של המכשיר EcoFAB. סביבות טבעיות, התגובה gravitropic שורשים מוביל להתפתחות בעיקר אנכי של מערכת השורשים. לפיכך, מערכת אופקית המובאת כאן סביר להניח שונה כמה גורמים של סביבה טבעית, הזיוף של מערכות EcoFAB עם המיקום האנכי של תא השורש הוא מטרה רצויה עבור גירסאות עתידיות של EcoFAB. למרות המכשירים EcoFAB הנוכחי ממוקמים אופקית, הניתוח של פרמטרים מורפולוגיה שורש בתנאים שונים, או בתגובה חיידקים, אפשרי. הדמיה ברזולוציה גבוהה ניתן להחיל כדי ללכוד שורש dynamics קולוניזציה של מבודד יחיד או קהילות, מתן מידע על הצמח אילו חלקים הם התנחלו בתנאים שונים מזין מספיק, לקוי. הוא צפוי כי מחקרים כאלה תספק תובנות חדשות חשובות איך צמח microbiomes הם, ו כיצד הדינמיקות האלה משתנים במשך הזמן, למשל כמו שורשי לפתח.
Microfluidic התקנים לאפשר הדמיה של צמחים צעירים מאוד, בדרך כלל הכמות של מטבוליטים שנאספו אינה מספקת עבור ניתוח איכות המזון. מערכות על בסיס אדמה, כגון rhizotrons, לאפשר ההדמיה של השורש מורפולוגיה כאשר גם הצמחים הופכים עם chemiluminescent לבנות (Glo-root) או עם שיטות מבוססות-NMR33,34. מטבוליט ושילוב מערכות אלה הם זמן רב בשל נפח גדול של דוגמאות. EcoFABs הם שילוב של שניהם: הזיוף דומה למכשירים microfluidic. EcoFABs נועדו להיות פשוט וזול להתרבות, אך ניתן לכוונן את הגודל של החדר לגדל צמחים עם מערכות שורשים קטן או גדול, ועד לשלבים הרבייה שלהם. תצפיות סימולטני של שינויים מורפולוגיה שורש, שורש exudation אפשריים. המערכת היא סטרילית, המאפשרים תוספת מבוקרת של חיידקים מסוימים.
EcoFABs נועדו לאפשר מבוא מבוקרת דגימה של חיידקים, מטבוליטים. באופן ספציפי, דגימות שנאסף תאי צמיחה השורש נמצאות להיות מספיק עבור יצירת פרופילים המטבוליט ספקטרוסקופיות המוני. השילוב של הדמיה ספקטרומטר מסה (למשל., נימס הטכניקה המובאת כאן) מספקת גישה גמישה ללמוד מטבוליט הפצות המרחבי של מערכות השורשים. טכניקה זו צפויה להיות מועיל איזוטופ יציב בעתיד עקיבה ניסויים ולוקליזציה מיפוי מיקרוביאלי מטבוליטים ספציפי36. בעוד פרוטוקול זה התמקדה מבודד יחיד, אותו עיצוב בהחלט ניתן לקהילות מורכבים יותר. אמצעי אחסון מדגם של ביומסה בתוך EcoFABs סביר יותר ממספקת. עבור שילוב נוסף עם טכנולוגיות רצף ה-DNA, אשר יהיה חשוב איפיון וניטור מבנה הקהילה מיקרוביאלי והביטוי ג’ין.
לסיכום, פרוטוקול זה פרטים הזיוף של מערכות אקולוגיות מעבדה מיועד החקירה של אינטראקציות צמח-חיידק, עם דגש על שיטות פשוטה ונגישה בקלות שניתן ליישם או המורחבת על ידי חוקרים ברחבי העולם. המאמצים הנוכחיים מכוונים הממחיש את הפארמצבטית בין מעבדות, השילוב של מערכת בקרת טמפרטורה כזה כי כל EcoFAB עצמאי שלטו אור וטמפרטורה. קידום נוסף המערכת יהיו השילוב של דגימה אוטומטית, מילוי מחדש של התאים שורש EcoFAB ופיתוח של פרוטוקולים לשחזור להקמת מפעל הרלוונטיים microbiomes בתוך EcoFABs.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מחקר ביים תוכנית פיתוח (LDRD) של המעבדה הלאומית לורנס ברקלי הנתמכים על ידי המשרד של המדע, של מחלקת האנרגיה של ארצות הברית תחת חוזה מס דה-AC02-05CH11231, פרס דה-SC0014079 ארה ב מחלקת אנרגיה במשרד למדע UC ברקלי. עבודה בבית היציקה מולקולרית נתמך תחת ארה ב המחלקה של אנרגיה חוזה מס דה-AC02-05CH11231. אנו מודים גם סוזן מ קוסינה, קתרין לואי, בנימין עמ’ בואן ו בנימין קול ג’יי-המעבדה הלאומית לורנס ברקלי על כל העזרה שלהם.
3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
Ethanol | VWR | 89125-172 | |
Bleach | |||
Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |