이 문서는 생태계 식물 및 높게 통제 된 실험실 조건에서 식물-미생물 상호작용 연구를 활성화 하는 장치 (EcoFABs)의 제조에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.
유용 식물-미생물 상호작용 가능성이 낮은 입력 음식과 bioenergy 생산 지속 가능한 생물 학적 솔루션을 제공 합니다. 이러한 복잡 한 식물 세균 상호 작용의 더 나은 기계적 이해 잘 수행 기본 생태 조사 식물-토양-미생물 상호작용으로 공장 생산 향상에 중요 한 될 것입니다. 여기, 생태계 제조에 대 한 상세한 설명을 제시, 특정 내 식물 세균 상호 작용의 기계 론 적인 연구에 대 한 환경 제어 실험실 서식 지 (EcoFABs)을 만드는 데 널리 3D 인쇄 기술를 사용 하 여 조건입니다. EcoFABs의 2 개 크기는 애기 thaliana, Panicum virgatum, Brachypodium distachyon, 등 다양 한 식물 종으로 미생물 상호 작용의 수사를 위해 적응 되는 설명 합니다. 이러한 흐름을 통해 장치 조작 제어 및 루트 microbiomes, 루트 화학의 샘플링으로 루트 형태학 및 미생물 지역화의 이미징에 대 한 허용. 이 프로토콜 EcoFABs 내부 살 균 상태를 유지 하 고 EcoFABs에 독립적인 LED 조명 시스템을 설치에 대 한 세부 정보를 포함 합니다. 토양을 포함 한 미디어의 다른 형태의 추가 대 한 자세한 방법 모래, 액체 성장 매체 이미지를 사용 하 여 이러한 시스템의 특성을 결합 하 고 대사체학 설명. 함께, 이러한 시스템 활성화 식물과 미생물 구성 (포함 돌연변이), 식물 성장, 루트 형태학, exudate 구성, 모니터링의 조작을 포함 한 식물 미생물 컨소시엄의 역동적이 고 상세한 조사 및 제어 환경 조건 하에서 미생물 지역화입니다. 우리는 이러한 상세한 프로토콜 이상적으로 식물-미생물 상호작용 조사를 위한 표준화 된 실험적인 시스템을 돕는 다른 연구원을 위한 중요 한 출발점으로 될 것입니다 예상.
농업에 유익한 식물 미생물의 응용 프로그램 지속 가능한 식품 및 바이오 연료 생산 증가 인구1,2,,34에 대 한 제공을 증가를 큰 잠재력을 제공 합니다. 작업의 상당한 양의 식물 양분 통풍 관, 스트레스, 관용 그리고 질병5,6,,78저항에에서 식물 microbiomes의 중요성을 지원합니다. 그러나, 그것은 필드 생태계의 복잡성 및 관련 된 irreproducibility과 미생물 구성 및 유전학을 정확 하 게 제어 하는 무 능력 때문에 식물-미생물 상호작용의 이러한 메커니즘을 조사 어렵다 (예., 사용 미생물 돌연변이)4,,910.
한 전략 수 있도록 단순화 된 모델 생태계를 구성 하는 제어, 복제 된 실험실 실험 조사 식물-미생물 상호작용 추가 필드10,11, 테스트할 수 있는 통찰력을 생성 하 12. 이 개념은 토양 가득 냄비에 성장 하는 식물을 사용 하 여 전통적인 접근에 또는 온실 또는 incubators13내 한 석판에 빌드합니다. 이러한 가능성이 남아 있지만 가장 널리 사용 되는 방법, 그들은 정확 하 게 모니터링 하 고 식물 성장 환경 조작 능력 부족. 이 끝을 rhizoboxes와 rhizotrons 주요 개선 아래 지상 프로세스14,15, 공부 하는 능력에 나타내고, 토양16rhizosphere 대사 산물을 분석 하기 위한 첫 번째 프로토콜 출판 되었다. 더 최근에, 높은 처리량 분석을 사용 하려면 고급 미세 장치13,17 공장 칩18,19,20, RootArray 및 RootChip21, 같은 되었습니다. 액체 흐름 중간에 작은 모델 식물 애기 thaliana 의 초기 성장 단계를 모니터링할 마이크로미터 스케일 공간 분해능 식물 형질에 대 한 효율적인 도구 개발. 최근, 2 층 영상 플랫폼 미세 플랫폼22묘 종 단계에서 애기 thaliana 의 루트 머리 이미징 수 있도록 설명 했다.
여기, 제어 실험실 장치 (EcoFABs)을 건설 하기를 위한 상세한 프로토콜 제공, 식물 세균 상호 작용을 연구 하 고 공연에 대 한 애기 thaliana, Brachypodium 포함 하 여 식물을 그들이 사용할 수 있는 다양 한 공부 하는 distachyon23, 생태학적으로 중요 한 야생 귀리 Avena barbata 고 bioenergy 작물 Panicum virgatum (switchgrass). EcoFAB는 두 가지 기본 구성 요소를 포함 하는 메 마른 식물 성장 플랫폼: EcoFAB 장치 및 살 균 식물 크기의 투명 한 컨테이너. 장치 제조 캐스팅 PDMS를 포함 하는 프로세스입니다 (PDMS)에서 만든 EcoFAB 3D 인쇄 된 플라스틱 몰드에서 레이어 및24,25 보고 메서드를 사용 하 여 이전 하는 현미경 슬라이드 위에 PDMS 레이어를 결합 . 이 프로토콜 (그림 1)에서 EcoFAB 워크플로, 장치 제조, 살 균, 종자 발 아, 모 종 이식, 미생물 접종/cocultivation, 샘플 준비, 분석, 등의 세부 절차를 설명 합니다. 기본 워크플로 추가 수정 설명, LED 성장 조명 및 고체 기판의 활용 제어 컴퓨터의 설치를 포함 하 여. 이미징 루트 형태 조사 기법 활용, 미생물 식민 뿌리의 변화와 루트 exudates의 대량 분 광 이미징 설명 되어 있습니다. 우리 여기, 상세한 프로토콜 뿐만 아니라 쉽게 사용할 수 있는 재료에 따라 단순, 저렴 한 디자인 커뮤니티 리소스에 EcoFAB 플랫폼을 돌 것 이다 실험실 식물-미생물 연구 표준화 예상.
프로토콜 보고 여기 생태계 제조를 사용 하 여 만드는 EcoFABs 매우 통제 된 실험실 조건에서 생물학 연구 체계적인 공장 커뮤니티 리소스 제공. 3D 인쇄에 발전 구성 하 고 EcoFAB 디자인을 반복적으로 정제에 대 한 광범위 하 게 액세스할 수 있는 기술을 제공 합니다. 여기에 제시 된 루트 챔버 현미경 이미징 및 불 임, 식물-미생물 상호작용을 조사 하기 위해 미생물의 제어 추가 사용을 유지 수 발견 된다. EcoFAB 플랫폼은 다양 한 식물 종에 호환 됩니다. 그것은 좁은 루트 챔버 내 식물을 성장 하는 추가 실험 자연 환경에서 성장 하는 식물에 연구 결과 일반화 하는 데 필요한 것입니다 그런의 생리 적 효과 인식 해야 합니다.
살 균 챔버와 LED 성장 빛의 사용 파장, 강도와 기간, 식물의 성장과 동시에 관련 된 생리 적 매개 변수를 포함 하 여 다양 한 조명 조건, 효과의 조사 수 있습니다. 가역 결합 루트 챔버 공간 생화학 및 유전 분석을 위한 고체 샘플을 수집으로 뿐만 아니라 고체 기판의 사용을 허용 합니다. 토양, 모래, 석 영 구슬 등 고체 기판의 응용 프로그램 EcoFABs를 사용 하 여 생태학적으로 관련 실험실 생태계 구축의 가능성을 제공 합니다. 그러나, 여기에 제시 된 사용 포화 액체 (수경 문화) 대부분 토양의 정확 하 게 반영 되지 않은 중요 한 것 더 모든 시스템 그들은 더 나은 대표는 토양 내의 공기 주머니를 유지 하기 위해 이러한 디자인 수정 자연 토양
간단한 카메라와 현미경을 사용 하 여 이미지 루트 시스템 형태 개발 모두 대량 세포 수준에서 설명 되어 있습니다. 이 적합성 모니터링 루트 형태학 이미징 및 정량화에 대 한 식물 생리 및 분자 신호 공장 genotypic adaptions 성장 조건에 의해 실행의 규제 메커니즘을 이해 하는 데 도움이 됩니다. 그러나, 생리 루트 개발 공부에 대 한 제한은 EcoFAB 장치의 현재 가로 배치입니다. 자연적인 환경에서 뿌리 gravitropic 응답 루트 시스템의 주로 수직 개발을 리드. 따라서, 및 자연 환경에서 몇 가지 요인에 다릅니다 가능성이 여기에 제시 된 수평 시스템 루트 챔버의 수직 위치와 EcoFAB 시스템의 제작은 미래 EcoFAB 버전에 대 한 바람직한 목표. 현재 EcoFAB 장치는 가로로 배치는, 비록 루트 형태학 매개 변수 다양 한 조건에서 또는, 미생물에 대 한 응답에서의 분석 가능 하다. 고해상도 이미지 캡처 단일 격리 또는 부품 다양 한 영양소 충분 하 고 부족 한 조건에서 식민지는 어떤 식물에 대 한 정보를 제공 하는 커뮤니티의 루트 식민 역학 적용할 수 있습니다. 그것은 이러한 연구 결과 식물 microbiomes 조립 방법, 그리고 이러한 역학 시간에 따라 변경 하는 방법에 중요 한 새로운 통찰력을 제공할 것입니다 예상, 뿌리로 예 개발.
미세 장치 사용 매우 어린 식물의 이미지 그리고 일반적으로 수집 하는 대사 산물의 양을 LCMS 분석에 대 한 충분 하지 않습니다. 토양 기반 시스템 rhizotrons, chemiluminescent 구문 (Glo-루트) 또는 NMR 기반 방법33,34중 식물 변형 때 루트 형태학의 이미지를 허용 한다. 이러한 시스템에서 대사 산물 기사는 대용량 샘플의 시간이 소요 됩니다. EcoFABs는 둘 다의 조합: 제조 미세 소자와 비슷합니다. EcoFABs는 간단 하 고 재현, 저렴 한 설계 되었습니다 하지만 작은 또는 큰 루트 시스템, 그들의 생식 단계와 식물을 성장 챔버의 크기를 조정할 수 있습니다. 루트 형태 변화와 루트 나옴의 동시 관측 가능 하다. 시스템은 살 균, 특정 미생물의 제어 추가 가능.
EcoFABs는 제어 소개 및 미생물 대사 산물의 샘플링 수 있도록 설계 되었습니다. 특히, 루트 성장 약 실에서 수집 된 샘플은 대량 분 광 대사 산물 프로 파일링에 대 한 충분 한 것 발견 된다. 질량 분석 이미징의 통합 (예., NIMS 기술은 여기에 제시 된) 루트 시스템의 대사 산물 공간 분포의 비 파괴적인 접근 방식을 제공 합니다. 이 기술은 도움이 미래에 안정 동위 원소 추적 실험 및 특정 대사 산물36매핑 미생물 지역화 됩니다. 이 프로토콜은 단일 격리를 중점적으로, 동일한 디자인은 더 복잡 한 사회에 대 한 확실히 사용할 수 있습니다. 샘플 볼륨 및 바이오 매스는 EcoFABs 내의 DNA 시퀀싱 기술의 더 통합에 대 한 충분 한 이상,이 중요 한 것 특성화 및 미생물 지역 사회 구조와 유전자 식 모니터링을 높습니다.
결론적으로,이 프로토콜 내용을 쉽게 구현 하 고 확장할 수 주위 연구자에 의해 간단 하 고 접근 방법에 중점을 두고 식물 세균 상호 작용의 수사를 위한 실험실 생태계의 제조는 세계입니다. 현재 노력 각 EcoFAB 것 이다는 독립적으로 제어 빛과 온도 실험실 및 온도 제어 시스템의 통합 간의 재현성을 보여주는 겨냥 된다. 자동된 샘플링의 통합과 관련 공장 microbiomes EcoFABs 내의 설정 재현 가능한 프로토콜의 개발과 EcoFAB 루트 챔버의 채우는 시스템의 더 발전 될 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품의 로렌스 버클리 국립 연구소 계약 번호에서 미국 에너지 부의 과학의 사무실에서 지 원하는 실험실 감독 연구 및 개발 (LDRD) 프로그램에 의해 지원 되었다 드-AC02-05CH11231 그리고 미국의 에너지 사무실의 과학 계열에서에서 UC 버클리를 상을 드 SC0014079. 분자 주조에서 작업 아래 미국 부의 에너지 계약 번호를 지원 했다 드-AC02-05CH11231입니다. 우리 또한 그들의 도움에 대 한 수잔 M. Kosina, 캐서린 루이, 벤자민 P. 보 웬과 로렌스 버클리 국립 연구소에서 벤자민 제이 콜을 감사합니다.
3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
Ethanol | VWR | 89125-172 | |
Bleach | |||
Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |