الغربية النشاف بروتوكول لإعداد صغيرة من الخلايا الجذعية المكونة للدم
Summary
الغربية قياسية النشاف البروتوكول الأمثل لتحليل عدد قليل من 500 الجذعية المكونة للدم أو الخلايا السلف. التحسين يشمل حذراً في التعامل مع العينة الخلية والحد من عمليات نقل بين أنابيب مباشرة ليسينج الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لنموذج لايمملي.
Abstract
الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) خلايا نادرة، مع الماوس نخاع العظام التي تحتوي على فقط 25,000 ~ المظهرية طويلة الأجل إعادة إسكانها يكونوا هسكس. وكان بروتوكول blotting غربية الأمثل ومناسبة لتحليل إعداد صغيرة من هسكس (500-15,000 الخلايا). هسكس المظهرية تنقيته، وحسابها بدقة، وتفكيك مباشرة في لايملي عينة المخزن المؤقت. ليساتيس التي تحتوي على إعداد متساوية من خلايا تم تحليلها بواسطة الصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، ووصمة عار وأعد وتجهيزها بعد الغربية القياسية النشاف البروتوكولات. باستخدام هذا البروتوكول، 2,000-5,000 هسكس يمكن تحليلها بصورة روتينية، وفي بعض الحالات يمكن الحصول على بيانات من عدد قليل من الخلايا 500، مقارنة بخلايا 20,000 إلى 40,000 عنها في معظم المنشورات. هذا البروتوكول ينبغي أن ينطبق عموما على الخلايا الأخرى المكونة للدم، ويتيح التحليل الروتيني لإعداد صغيرة من الخلايا باستخدام الإجراءات المختبرية القياسية.
Introduction
الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) هي الذاتي تجديد الخلايا التي يمكن أن تؤدي إلى جميع الدم الأنساب. فهي نادرة نسبيا من الخلايا في نخاع العظام، يجعل من الصعب التحليلات الكيميائية الحيوية. النهج المناسبة لتحليل خلايا نادرة، مثل التدفق الخلوي، كانت مفيدة للغاية لقياس الكميات النسبية من علامات سطح الخلية والبروتينات داخل الخلايا. ومع ذلك، يتطلب تحليل البروتينات داخل الخلايا باستخدام الخلية بيرميبيليزيشن إجراءات لتمكين الوصول إلى جسم، وليس كل الخلايا السطحية [ابيتوبس] البقاء على قيد الحياة هذه الإجراءات1،2. وباﻹضافة إلى ذلك، الأجسام المضادة التي تميز بين منتجات بروتين مختلف isoforms أو الانقسام ولا تتوفر غالباً للتدفق الخلوي، وذلك المحققين لا تزال تعتمد على البقع الغربية لبعض أنواع التحليل.
تحليل لطخة غربية للخلية ليساتيس إجراء روتيني في معظم المختبرات. يمكن تنقية الخلايا تحت ظروف الأم التي تحافظ على [ابيتوبس] جزيئات سطح الخلية، ويمكن بعد ذلك أعد ليساتيس الخلية وتحليلها. ومع ذلك، يمكن أن يتطلب تحليل البروتينات في الخلية الأولية نادرة السكان بالغربية لطخة يوثانيزينج إعداد كبيرة من الحيوانات للحصول على ما يكفي من خلايا. بإجراء تعديلات صغيرة على عدة خطوات، كان بروتوكول blotting غربية تقليدية قادرة على الكشف عن البروتينات في عدد قليل نسبيا من هسكس (500-15,000، اعتماداً على بروتين الفائدة). وتشمل التعديلات بدقة عد الخلايا، بدقة التعامل مع الخلية بيليه، الحد من عمليات نقل الخلايا بين أنابيب تقليل الخسائر في الخلية، وليسينج عدد محدد من الخلايا مع تحميل تتركز العازلة التي تحتوي على بروتوزوم و مثبطات الفوسفاتيز. وتشمل العديد من التقارير المنشورة البقع الغربية التي تم الحصول عليها مع 20,000 أو أكثر هسكس3،،من45،،من67؛ سوف يقلل هذا الإجراء البسيط عدد الخلايا والحيوانات التجريبية اللازمة لإنتاج بيانات مكافئة من بين 4 و 40 ضعفا. البروتوكول يهدف إلى تطبيع النتائج على أساس كل خلية، بدلاً من رقابة داخلية. وهذا يتيح الكشف عن التخفيضات الإجمالية في مستويات البروتين التي يمكن التغاضي عنها إذا هي تطبيع البيانات إلى رقابة داخلية. ووصفت أهمية تطبيع على أساس كل خلية لتحليل البيانات التعبير الجيني8، وينطبق نفس المبدأ على تحديد كمية البروتينات بوصمة عار الغربية. هذا البروتوكول الأمثل ينبغي أن يكون مفيداً لأي شخص بحاجة إلى تحليل عدد صغير من الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
النشاف الغربية تقنية شائعة لكشف البروتينات المحددة وتفعيل مسارات الإشارات في الأنسجة أو الخلايا. عن طريق إدخال تعديلات بسيطة على إجراء استخداماً، كنا قادرين على اكتشاف البروتينات المختلفة 15 (جدول المواد) بشكل روتيني في هسكس 15,000، وفي بعض الحالات في عدد قليل من هسكس 500. The most الخطوا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المعاهد الوطنية “للصحة” منح R01 CA149976 (N.A.S) تدعم هذا العمل.
Materials
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrylamidel Bis solution | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-protean 3 comb | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
Mini-PROTEAN Tetra Cell |
Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Transfer System | Bio-Rad | 1704155EDU | transfer |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052EDU | electrophoresis |
| Imaging System | Bio-Rad | 1708195 | signal detection |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | sample preparation |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | electrophoresis |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | sample preparation |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots | Bio-Rad | 1704272 | transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | sample preparation |
| Phosphatase Inhibitor Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | sample preparation |
| EIF4G | Cell signaling | 2469 | WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| p-Rps6 | Cell signaling | 4858 | WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| actin(HRP conjugated) | abcam | ab49900 | WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | 4877 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| actin | Santa Cruz | sc-47778 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| lineage depletion kit (mouse) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| SCF | PeproTech | 250-03 | phosphorylation stimulation |
| APC-Cy7 c-kit antibody | ThermoFisher | A15423 | cell sorting |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | cell sorting |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | cell sorting |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | cell sorting |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | cell sorting |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | cell sorting |
| Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | membrane blocking |
| serum | Atlanta Biologicals | A12450 | medium supplement |
| cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | cell counting |
| hemocytometer | ThermoFisher | S17040 | cell counting |
| flim | Denville Scientific | E3012 | signal detection |
| medical film processor | Konica | SRC-101A | signal detection |
| Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Therom Scientific | 34096 | signal detection |
| Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | sample preparation |
| BLUEstain protein ladder | Gold Biotechnology | P007-500 | electrophoresis |
| cell sorter | BD | FACSAria II | sample preparation |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | electrophoresis |
Riferimenti
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).
- Du, J., et al. Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells. Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).
- Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).
- Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).
- Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).
- Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).
- Cai, X., et al. Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Stem Cell. , (2015).
- Loven, J., et al. Revisiting global gene expression analysis. Cell. 151 (3), 476-482 (2012).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemoacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
