Un Western Blot protocolo para una pequeña cantidad de células madre hematopoyéticas
Summary
Un estándar de Western Blot protocolo fue optimizado para el análisis de tan sólo 500 madre hematopoyética o células progenitoras. Optimización implica la cuidadosa manipulación de la muestra de células, limitando las transferencias entre los tubos y directamente lisis de las células en Tampón Laemmli.
Abstract
Las células madre hematopoyéticas (HSCs) son las células raras, con la médula ósea de ratón con sólo 25.000 ~ fenotípica largo plazo HSCs repoblamiento. Un Western Blot protocolo fue optimizado y adecuado para el análisis de una pequeña cantidad de HSCs (células 500-15.000). HSCs fenotípicas fueron purificadas, contó con precisión y lisis directamente en Tampón Laemmli. Lisados que contiene igual número de células se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE), y lo blot fue preparado y procesadas siguiendo el estándar de Western Blot protocolos. Mediante este protocolo, 2.000-5.000 HSCs pueden analizarse de forma rutinaria, y en algunos casos pueden obtenerse datos de tan sólo 500 células, en comparación con las células de 20.000 a 40.000 registradas en la mayoría de las publicaciones. Este protocolo debe aplicarse generalmente a otras células hematopoyéticas y permite el análisis de rutina de un pequeño número de células utilizando procedimientos estándar del laboratorio.
Introduction
Las células madre hematopoyéticas (HSCs) son células renueva a sí misma que pueden dar lugar a todos los linajes de sangre. Son células relativamente raras en la médula ósea, haciendo difícil los análisis bioquímicos. Enfoques adecuados para el análisis de células, como la citometría de flujo, han sido extremadamente útiles para cuantificar cantidades relativas de los marcadores de superficie celular y proteínas intracelulares. Sin embargo, el análisis de proteínas intracelulares requiere la utilización de procedimientos de permeabilización celular para permitir el acceso del anticuerpo, y no todos celular epitopos superficiales sobreviven estos procedimientos1,2. Además, anticuerpos que discriminan entre productos de diferentes proteínas isoformas o hendidura a menudo no están disponibles para citometría de flujo, y por lo tanto, los investigadores todavía dependen de Western blot para ciertos tipos de análisis.
Mancha blanca /negra occidental análisis de lysates de la célula es un procedimiento rutinario en la mayoría de los laboratorios. Las células se pueden purificar en condiciones nativas que conservan los epitopos de moléculas de superficie celular, y lysates de la célula puede preparado y analizado posteriormente. Sin embargo, el análisis de proteínas en célula de primaria rara poblaciones por Western blot puede requerir euthanizing grandes cantidades de animales para obtener suficientes células. Haciendo pequeños ajustes en varios pasos, un protocolo Blot Western convencional fue capaz de detectar proteínas en un número relativamente pequeño de HSCs (500-15.000, dependiendo de la proteína de interés). Los ajustes incluyen exactamente contando las células, manipular cuidadosamente el sedimento celular, reducir las transferencias de células entre tubos para minimizar la pérdida de la célula, y lisis de un número determinado de células con una carga concentrada tampón que contiene proteasoma y inhibidores de la fosfatasa. Muchos informes publicados incluyen manchas blancas /negras occidentales obtenidas con 20.000 o más HSCs3,4,5,6,7; Este sencillo procedimiento reducirá el número de células y animales de experimentación necesarios para producir datos equivalentes por entre 4 y 40 veces. El protocolo está diseñado para normalizar los resultados en una base por células, en lugar de un control interno. Esto permite la detección de la reducción general en los niveles de proteína que pueden pasarse por alto si los datos se normalizan a un control interno. La importancia de la normalización de una base por celular fue descrita para el análisis de de datos de expresión génica8, y el mismo principio se aplica a la cuantificación de proteínas por Western blot. Este protocolo optimizado debe ser útil para cualquier persona que necesite analizar una pequeña cantidad de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
Western Blot es una técnica común para la detección de proteínas específicas y la activación de vías de señalización en los tejidos o células. Mediante la introducción de pequeños ajustes a un procedimiento de uso general, hemos sido capaces de detectar rutinariamente 15 diversas proteínas (Tabla de materiales) en 15.000 HSCs y en algunos casos en tan solo 500 HSCs. The Most pasos críticos en este protocolo son: 1) exactamente contando las células 2) reduciendo al mínimo el número de tra…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Institutos nacionales de salud otorgar R01 CA149976 (N.A.S) apoyado este trabajo.
Materials
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrylamidel Bis solution | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-protean 3 comb | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
Mini-PROTEAN Tetra Cell |
Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Transfer System | Bio-Rad | 1704155EDU | transfer |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052EDU | electrophoresis |
| Imaging System | Bio-Rad | 1708195 | signal detection |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | sample preparation |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | electrophoresis |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | sample preparation |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots | Bio-Rad | 1704272 | transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | sample preparation |
| Phosphatase Inhibitor Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | sample preparation |
| EIF4G | Cell signaling | 2469 | WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| p-Rps6 | Cell signaling | 4858 | WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| actin(HRP conjugated) | abcam | ab49900 | WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | 4877 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| actin | Santa Cruz | sc-47778 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| lineage depletion kit (mouse) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| SCF | PeproTech | 250-03 | phosphorylation stimulation |
| APC-Cy7 c-kit antibody | ThermoFisher | A15423 | cell sorting |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | cell sorting |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | cell sorting |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | cell sorting |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | cell sorting |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | cell sorting |
| Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | membrane blocking |
| serum | Atlanta Biologicals | A12450 | medium supplement |
| cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | cell counting |
| hemocytometer | ThermoFisher | S17040 | cell counting |
| flim | Denville Scientific | E3012 | signal detection |
| medical film processor | Konica | SRC-101A | signal detection |
| Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Therom Scientific | 34096 | signal detection |
| Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | sample preparation |
| BLUEstain protein ladder | Gold Biotechnology | P007-500 | electrophoresis |
| cell sorter | BD | FACSAria II | sample preparation |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | electrophoresis |
Riferimenti
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- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
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