Summary

Synthese- und Massenspektrometrie der Oligo-peptoids

Published: February 21, 2018
doi:

Summary

Ein Protokoll wird für die manuelle Synthese von Oligo-Peptoids gefolgt von Sequenzanalyse durch Massenspektrometrie beschrieben.

Abstract

Peptoids sind Sequenz-gesteuerte Peptid imitiert Oligomere bestehend aus N-alkyliert Glycin Einheiten. Unter vielen möglichen Anwendungen haben Peptoids als eine Art molekulare Informationsspeicherung gedacht. Massenspektrometrie-Analyse ist die Methode der Wahl für die Sequenzierung Peptoids betrachtet worden. Peptoids können über feste Phase Chemie mit einer sich wiederholenden zweistufigen Reaktionszyklus synthetisiert werden. Hier präsentieren wir eine Methode, Oligo-Peptoids manuell zu synthetisieren und die Reihenfolge der Peptoids mit Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) Techniken zu analysieren. Die Probe Peptoid ist ein Nonamer bestehend aus abwechselnd N-(2-Methyloxyethyl) Glycin (Nme) und N-(2-Phenyl) Glycin (Npe) sowie eine N-(2-Aminoethyl) Glycin (Nae) am N-Terminus. Die Sequenz-Formel von der Peptoid ist Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, wo Ac die Acetyl-Gruppe. Die Synthese erfolgt in einem handelsüblichen Festphasen-Reaktionsgefäß. Die Eisbahn Amid Harz dient als solide Unterstützung um die Peptoid mit einem Amid-Gruppe am C-Terminus zu erzielen. Das resultierende Peptoid Produkt unterliegt Sequenzanalyse mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer gekoppelt an eine Electrospray Ionisierung Quelle. Die MS/MS-Messung erzeugt ein Spektrum der Fragment-Ionen aus der Dissoziation des geladenen Peptoid. Der Fragment-Ionen sind je nach den Werten ihrer Masse-Ladungs-Verhältnis (m/Z) sortiert. Die m/Z-Werte der Fragment-Ionen werden gegen die nominalen Massen der theoretisch vorhergesagten Fragment-Ionen, nach dem Schema der Peptoid Fragmentierung verglichen. Die Analyse erzeugt eine Fragmentierung Muster der geladenen Peptoid. Die Fragmentierung Muster ist der Monomer-Reihenfolge der neutralen Peptoid korreliert. In diesem Zusammenhang liest MS-Analyse die Sequenzinformation von der Peptoids.

Introduction

Peptoids sind eine Klasse von Sequenz-gesteuerte Polymere mit Rückgrat Strukturen imitiert die Struktur von Peptiden. Peptoids können aus verschiedenen Aminen synthetisiert werden, ermöglicht Peptoids, höchst abstimmbaren Eigenschaften1,2auszustellen. Peptoids wurden als molekulare Modelle für biophysikalische Forschung, als Therapeutika und konzipiert als Liganden für Proteine3,4,5,6verwendet. Peptoids wurden in einer Vielzahl von biologisch aktiven Verbindungen, wie z. B. Anti-fouling und Antikörper-mimetischen Materialien, antimikrobielle Wirkstoffe und Enzym-Inhibitoren7,8,9entwickelt. Mit einer sehr geordnet und abstimmbaren Natur haben Peptoids auch als eine Art von molekularen Informationen Speicher10gedacht. Die Entdeckung dieser vielfältigen Anwendungen erfordert die Entwicklung von effizienten Analysemethoden zur Charakterisierung der Sequenzablaufs und Struktur des Peptoids. Tandem mass Spectrometry-basierte Techniken haben Versprechen als die Methode der Wahl für die Analyse der Sequenz Eigenschaften der Sequenz-gesteuerte Polymere, einschließlich Peptoids11,12,13gezeigt, 14,15. Jedoch systematische Studien korrelieren die Peptoid Ion Fragmentierung Muster aus mass Spectrometry Studien und die Strukturinformationen von Peptoids sind sehr begrenzt.

Peptoids können leicht mit einem festen Phase Verfahren synthetisiert werden. Die gut entwickelte Methode beinhaltet eine Iteration einer zweistufigen Monomer Zusatz Zyklus16,17. In jedem Zyklus zusätzlich ein Harz-gebundene Amin ist durch eine Halogenessigsäuren Säure (in der Regel Bromoacetic Säure, BMA) acetyliert, und dies ist gefolgt von einer Versetzung Reaktion mit ein primäres Amin. Obwohl automatisierte Synthese Protokolle für Peptoid Synthese routinemäßig angewendet wurden, können Peptoids manuell mit sehr guten Ausbeuten in einem standard Chemie Labor16,18,19, synthetisiert werden 20.

Unser Labor hat hat die Methode der manuellen Peptoid Synthese und vereinfacht das Gerät in die bestehenden Methoden verwendet. Wir haben vorher die Fragmentierung Muster aus einer Reihe von Peptoids mit MS/MS Techniken21,22,23studiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Peptoids charakteristische Fragmentierungen produzieren, wenn sie einer Kollision-induzierte Dissoziation (CID)21,23 unterliegen oder Elektroneneinfang Dissoziation (ECD)22 Experimente. In diesem Artikel zeigen wir wie Oligo-Peptoids in einem standard Chemielabor synthetisiert werden kann, wie mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer CID-Experimente durchführen und wie die spektralen Daten analysieren. Die Peptoid synthetisiert und charakterisiert ist ein Nonamer mit N-terminale Acetylierung und C-terminalen Amidierung, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Die Struktur der Peptoid ist in Abbildung 1dargestellt.

Protocol

(1) Synthese von Peptoid Hinweis: Die Synthese beginnt mit Aktivierung der Harz durch Schwellung des Harzes und der Schutzgruppe entfernen. Danach wächst die Peptoid Kette an das Harz durch Monomer Zusatz Zyklen wiederholen. Die ersten Monomer, gekoppelt an das Harz ist der C-terminalen Rückstand. Die Peptoid ist aus dem C-Terminus an den N-Terminus länglich. Sobald die gewünschte Peptoid Sequenz erreicht ist, ist das Harz aus gespalten und das Peptoid Produkt gereinigt. …

Representative Results

Die Struktur von einem 9-Mer Peptoid mit N-terminale Acetylierung, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, ist in Abbildung 1dargestellt. Die Peptoid wurde manuell in einem fritted Polypropylen Reaktionsgefäß über Festphase Ansatz synthetisiert. Eisbahn Amid Harz (0,047 Mmol, 84 mg mit be-0.56 Mmol/g) dient als solide Unterstützung um die Peptoid mit einem niedrigmethylierte C-Terminus zu erzielen. Die Peptoid-Kette ist durch mehrere Zyklen von Monom…

Discussion

Ein Nonamer Peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, hat unter Verwendung des Protokolls präsentiert synthetisiert. Die Synthese-Apparat beinhaltet eine Spritze wie Polypropylen Festphasen-Reaktionsgefäß und einem mechanischen Schüttler. Die Reaktionsgefäße sind kommerziell verfügbar und kostengünstig. Einem mechanischen Schüttler ist ein gemeinsamen Apparat in Chemie-Laboratorien. Mithilfe einer Spritze wie Reaktionsgefäß werden Lösungen hineingezogen und das Schiff durch manuelles Verschieben d…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten Herr Michael Connolly und Dr. Ronald Zuckermann (The Molecular Foundry, Lawrence Berkeley National Laboratory) für Technik-Support in Peptoid Synthese danken. Wir anerkennen die Unterstützung durch die National Science Foundation (CHE-1301505). In der Chemie Mass Spectrometry Einrichtung an der University of the Pacific wurden alle Massenspektrometrie Experimente durchgeführt.

Materials

ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L Agilent Technologies Inc. The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc.
Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software Varian Inc. The software is a part of the Varian 320L package
Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD Fisher Scientific International Inc. 14-400-126
Hermle Centrifuge, Model Z 206 A Hermle Labortechnik GmbH
Solid phase reaction vessel, 10 mL Torviq SF-1000
Pressure caps for reaction vessels Torviq PC-SF
Syringe filters, pore size 0.2 μm Fisher Scientific Inc. 03-391-3B
Syringe filters, pore size 0.45 μm Fisher Scientific Inc. 03-391-3A
Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL VWR International, LLC. 490001-626
Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL VWR International, LLC. 490001-620
ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 CambridgeSoft Corporation CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc.
Styrofoam cup, 12 Oz Common Supermarket
Rink amide resin Chem-Impex International, Inc. 10619
Piperidine Chem-Impex International, Inc. 02351 Highly toxic
N, N’-diisopropylcarbodiimide Chem-Impex International, Inc. 00110 Highly toxic
Bromoacetic acid Chem-Impex International, Inc. 26843 Highly toxic
2-Phenylethylamine VWR International, LLC. EM8.07334.0250
2-Methyoxyethylamine Sigma-Aldrich Co. LLC. 241067
N-Boc-ethylenediamine VWR International, LLC. AAAL19947-06
Acetic anhydride Sigma-Aldrich Co. LLC. 252845
N, N-dimethylformamide VWR International, LLC. BDH1117-4LG Further distillation before use
N, N-diisopropylethylamine Chem-Impex International, Inc. 00141
Triisopropylsilane Chem-Impex International, Inc. 01966
Trifluoroacetic acid Chem-Impex International, Inc. 00289 Highly toxic
Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System Millipore Corporation ZMQP60001 For generating HPLC grade water
HPLC-grade Water Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System
Methanol Pharmco-Aaper 339USP/NF HPLC grade
Acetonitrile Fisher Scientific International, Inc. A998-4 HPLC grade
Diethyl ether VWR International, LLC. BDH1121-19L Further distillation before use
Dichloromethane VWR International, LLC. BDH1113-19L Further distillation before use
Nitrogen gas Fresno Oxygen/Barnes Supply NIT 50-C-F Ultra high purity, 99.9995%
Argon gas Fresno Oxygen/Barnes Supply ARG 50-C-F Ultra high purity, 99.9995%

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Citazione di questo articolo
Ren, J., Mann, Y. S., Zhang, Y., Browne, M. D. Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids. J. Vis. Exp. (132), e56652, doi:10.3791/56652 (2018).

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