Síntese e análise de espectrometria de massa de Oligo-peptoids
Summary
Um protocolo é descrito para a síntese manual de oligo-peptoids seguido por análise de sequência por espectrometria de massa.
Abstract
Peptoids são oligômeros peptídeo-imitando sequência controlada constituído por unidades de N-alquilados de glicina. Entre muitas aplicações potenciais, peptoids ter sido pensado como um tipo de armazenamento de informação molecular. Análise de espectrometria de massa tem sido considerada o método de escolha para peptoids de sequenciamento. Peptoids podem ser sintetizados via química de fase sólida usando um repetição ciclo de reação em duas fases. Aqui nós apresentamos um método para sintetizar manualmente oligo-peptoids e analisar a sequência do peptoids usando técnicas de espectrometria de massa (MS/MS) em tandem. A amostra peptoid é um nonamer consistindo de alternadas de N-(2-methyloxyethyl) glicina (Nme) e N-(2-feniletílico) glicina (Npe), bem como uma N-(2-aminoetil) glicina (Nae) no N-terminal. A fórmula de sequência do peptoid é Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, onde Ac é o grupo acetila. A síntese ocorre em uma embarcação da reação de fase sólida comercialmente disponível. A resina de Amida rinque é usada como o sólido apoio para produzir o peptoid com um grupo de amido no C-terminal. O produto resultante do peptoid é submetido a análise de sequência usando um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo, acoplado a uma fonte de ionização electrospray. A medição de MS/MS produz um espectro de íons fragmento resultante da dissociação do peptoid carregado. Os íons de fragmento são classificados com base nos valores de sua relação massa-de-carga (m/z). Os valores de m/z dos íons fragmento são comparados com as massas nominais de íons do fragmento teoricamente previsto, de acordo com o esquema de peptoid de fragmentação. A análise gera um padrão de fragmentação do peptoid carregado. O padrão de fragmentação é correlacionado com a sequência de monômero do peptoid neutro. A este respeito, MS análise lê as informações de sequência do peptoids.
Introduction
Peptoids são uma classe de polímeros sequência controlada com estruturas de espinha dorsal, imitando a estrutura de peptídeos. Peptoids pode ser sintetizado a partir diversas aminas, que permite peptoids a expor propriedades altamente sintonizável1,2. Peptoids têm sido utilizados como modelos moleculares para pesquisas biofísicas, considerados como agentes terapêuticos e concebido como ligantes para proteínas3,4,5,6. Peptoids foram desenvolvidos em uma variedade de compostos biologicamente ativos, tais como materiais anti-incrustantes e anticorpo-mimética, agentes antimicrobianos e inibidores de enzima7,8,9. Com uma natureza altamente ordenada e ajustável, peptoids têm também sido pensado como um tipo de armazenamento de informação molecular10. A descoberta dessas chamadas de diversas aplicações para o desenvolvimento de métodos analíticos eficientes para caracterizar a sequência e estrutura de peptoids. Técnicas de espectrometria de massa em tandem-baseado mostraram a promessa como o método de escolha para analisar as propriedades de sequência de polímeros sequência controlada, incluindo peptoids11,12,13, 14,15. No entanto, estudos sistemáticos, correlacionando os padrões de fragmentação do íon peptoid resultantes de estudos de espectrometria de massa e as informações estruturais de peptoids são muito limitados.
Peptoids podem ser facilmente sintetizados usando um método de fase sólida. O método desenvolvido envolve uma iteração de um monômero do Two-Step adição ciclo16,17. Em cada ciclo de adição, uma amina ligados a resina é acetilada por um haloacetic ácido (normalmente bromoacético BMA), e este é seguido por uma reação de deslocamento com uma amina primária. Embora a síntese automatizado protocolos foram rotineiramente aplicados para a síntese de peptoid, peptoids podem ser sintetizados manualmente com excelente rendimento em um padrão química laboratório16,18,19, 20.
Nosso laboratório tem adotado o método da síntese de peptoid manual e simplificado o aparelho utilizado nos métodos existentes. Estudamos, anteriormente, os padrões de fragmentação de uma série de peptoids, usando técnicas de MS/MS21,22,23. Nossos resultados mostram que peptoids produzir fragmentações características quando eles estão sujeitos a dissociação induzida por colisão (CID)21,23 ou captura eletrônica-experiências de dissociação (ECD)22 . Neste artigo, demonstramos como oligo-peptoids pode ser sintetizado em um laboratório de química padrão, como a realizar os experimentos de CID usando um espectrômetro de massa triplo-quadrupolo e como analisar os dados espectrais. O peptoid a ser sintetizado e caracterizado é um nonamer com Acetilação N-terminal e C-terminal amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. A estrutura da peptoid é mostrada na Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um peptoid nonamer, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, tem sido sintetizado usando o protocolo apresentado. O aparelho de síntese envolve uma embarcação da reação de fase sólida polipropileno como seringa e um agitador mecânico. Os vasos de reação são comercialmente disponíveis e de baixo custo. Um agitador mecânico é um aparelho comum em laboratórios de química. Com o uso de uma embarcação da reação como seringa, soluções podem ser sugadas e empurradas para fora do navio, manualmente, move…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer o Sr. Michael Connolly e Dr. Ronald Zuckermann (The Foundry Molecular, Lawrence Berkeley National Laboratory) técnica apoio na síntese de peptoid. Reconhecemos o apoio da Fundação Nacional de ciência (-1301505). Todos os experimentos de espectrometria de massa foram realizados na instalação de espectrometria de massa de química na Universidade do Pacífico.
Materials
| ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L | Agilent Technologies Inc. | The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc. | |
| Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software | Varian Inc. | The software is a part of the Varian 320L package | |
| Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD | Fisher Scientific International Inc. | 14-400-126 | |
| Hermle Centrifuge, Model Z 206 A | Hermle Labortechnik GmbH | ||
| Solid phase reaction vessel, 10 mL | Torviq | SF-1000 | |
| Pressure caps for reaction vessels | Torviq | PC-SF | |
| Syringe filters, pore size 0.2 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3B | |
| Syringe filters, pore size 0.45 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3A | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL | VWR International, LLC. | 490001-626 | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL | VWR International, LLC. | 490001-620 | |
| ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 | CambridgeSoft Corporation | CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc. | |
| Styrofoam cup, 12 Oz | Common Supermarket | ||
| Rink amide resin | Chem-Impex International, Inc. | 10619 | |
| Piperidine | Chem-Impex International, Inc. | 02351 | Highly toxic |
| N, N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex International, Inc. | 00110 | Highly toxic |
| Bromoacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 26843 | Highly toxic |
| 2-Phenylethylamine | VWR International, LLC. | EM8.07334.0250 | |
| 2-Methyoxyethylamine | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 241067 | |
| N-Boc-ethylenediamine | VWR International, LLC. | AAAL19947-06 | |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 252845 | |
| N, N-dimethylformamide | VWR International, LLC. | BDH1117-4LG | Further distillation before use |
| N, N-diisopropylethylamine | Chem-Impex International, Inc. | 00141 | |
| Triisopropylsilane | Chem-Impex International, Inc. | 01966 | |
| Trifluoroacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 00289 | Highly toxic |
| Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System | Millipore Corporation | ZMQP60001 | For generating HPLC grade water |
| HPLC-grade Water | Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System | ||
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339USP/NF | HPLC grade |
| Acetonitrile | Fisher Scientific International, Inc. | A998-4 | HPLC grade |
| Diethyl ether | VWR International, LLC. | BDH1121-19L | Further distillation before use |
| Dichloromethane | VWR International, LLC. | BDH1113-19L | Further distillation before use |
| Nitrogen gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | NIT 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
| Argon gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | ARG 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
Riferimenti
- Sun, J., Zuckermann, R. N. Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material. ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).
- Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).
- Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).
- Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor. J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).
- Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells. J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).
- Patch, J. A., Barron, A. E. Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide. J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).
- Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).
- Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition. ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).
- Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of β-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs. ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).
- Lutz, J. -. F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. Sequence-Controlled Polymers. Science. 341 (6146), 628 (2013).
- Altuntas, E., Schubert, U. S. “Polymeromics”: Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review. Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).
- Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).
- Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).
- Sarma, B. K., Kodadek, T. Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library. ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).
- Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis. Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).
- Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
- Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).
- Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory. J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).
- Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).
- Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J Vis Exp. (117), (2016).
- Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition. Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).
- Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).
- Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).
