Summary

Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

Published: February 06, 2018
doi:

Summary

Nós descrevemos um método para a produção de anticorpos humanos específicos para um antígeno de interesse, a partir de raras células B que circulam no sangue humano. Geração destes anticorpos naturais é rápida e eficiente, e os anticorpos obtidos podem discriminar entre antígenos altamente relacionados.

Abstract

Anticorpos monoclonais (mAbs) são poderosas ferramentas úteis para ambas as pesquisas fundamentais e em biomedicina. Sua alta especificidade é indispensável quando o anticorpo precisa distinguir entre estruturas altamente relacionadas (por exemplo, uma proteína normal e uma versão mutante respectivas). A maneira atual de gerar tais discriminatórios mAbs envolve extensa seleção de várias células B produtoras de Ab, que é caro e demorado. Propomos aqui um método rápido e econômico para a geração de discriminativa, mAbs plenamente humano a partir de sangue humano circulam os linfócitos B. A originalidade desta estratégia é devido a seleção de células de ligação B antígeno específico combinado com a Counter-seleção de todas as outras células, usando prontamente disponível periférico sangue mononucleares células (PBMC). Uma vez que células B específicas são isoladas, sequências de cDNA (complementar ácido desoxirribonucleico) que codifica para o mAb correspondente são obtidas usando a tecnologia de célula única reverso transcrição-cadeia da polimerase (RT-PCR) e posteriormente expressos em humanos células. Dentro de menos de 1 mês, é possível produzir miligramas de mAbs humana altamente discriminativa, dirigido contra praticamente qualquer antígeno desejado naturalmente detectado pelo repertório de células B.

Introduction

O método descrito aqui permite a produção rápida e versátil de totalmente humanas-anticorpos monoclonais (mAbs) contra um antígeno desejado (Ag). Celia é ferramentas essenciais em muitas aplicações de investigação fundamental em vitro e em vivo: fluxo cytometry, histologia, mancha ocidental, bloqueio e experimentos, por exemplo. Além disso, mAbs estão sendo usados cada vez mais na medicina para tratar doenças auto-imunes, câncer e controle de rejeição de transplante1. Por exemplo, mAbs anti-CTLA-4 e anti-PD-1 (ou anti-PD-L1) foram recentemente usados como inibidores de ponto de verificação imune em tratamentos de câncer2.

Os primeiros mAbs foram produzidos por imunoglobulinas (Ig)-secretoras de hibridomas obtidos a partir das células no baço de ratos imunizados ou ratos. No entanto, a forte resposta imune contra murino ou rato mAbs dificulta seu uso terapêutico em humanos, devido a sua rápida liberação e a provável indução de reações de hipersensibilidade3. Para resolver este problema, sequências de proteína animal de mAbs foram parcialmente substituídas por dos humanos para gerar anticorpos chamados de rato-humano ou humanizados quiméricoes. No entanto, esta estratégia apenas parcialmente diminui imunogenicidade, aumentando substancialmente tanto o custo e o tempo-escala de produção. Uma solução melhor é gerar mAbs humano diretamente de células humanas de B e várias estratégias para isso estão disponíveis. Um deles é o uso do fago ou fermento de exibição. Isto envolve exibindo domínios variáveis de uma biblioteca combinatorial de Ig humana aleatória pesado e luz encadeia no fago ou leveduras e realização de uma etapa de seleção usando o antígeno específico de interesse. Uma grande desvantagem dessa estratégia é que correntes pesadas e claras são aleatoriamente associadas, levando a um aumento muito grande na diversidade de anticorpos gerados. Anticorpos obtidos são improváveis corresponder a aqueles que surgem de uma resposta imune natural contra um particular Ag. Além disso, dobradura de proteína humana e modificações borne-translational não são sistematicamente reproduzidas em procariontes ou mesmo em leveduras. Um segundo método de produção humana mAb é o immortalization de células B humanas naturais, pela infecção do vírus Epstein – Barr ou expressão dos fatores anti apoptótica BCL-6 e BCL-XL4. No entanto, este método é aplicável apenas às células de memória B e ineficiente, que exige triagem de numerosos mAb imortalizado B células que produzem a identificar os clones mAb poucos (se houver) com a especificidade antigênica desejada. O método é, portanto, caro e demorado.

Recentemente foi descrito um novo protocolo para produção de mAbs humano isolado único B células5. Baseia-se em um otimizado monocelulares reverter transcrição-cadeia da polimerase (RT-PCR) para amplificação de ambos os pesados e luz-cadeia codificação segmentos a partir de uma única célula B classificada. Isto é seguido pela clonagem e expressão desses segmentos em um sistema de expressão eucarióticos, permitindo assim a reconstrução de um mAb plenamente humano. Este protocolo tem sido usado com sucesso a partir de células B de doadores vacinados. As células foram colhidas várias semanas após a vacinação para obter frequências mais altas de células B dirigidas contra o Ag desejado e, portanto, limitar o tempo necessário para a seleção de6. Também foram produzidos outros mAbs plenamente humanos de infectados pelo HIV+ (vírus de imunodeficiência humana) pacientes7 e melanoma pacientes8. Apesar destes avanços, ainda não há nenhum procedimento disponível que permite o isolamento de células B Ag específico independentes de seu fenótipo de memória ou frequência.

O procedimento descrito aqui leva a isolamento eficiente ex vivo de células humanas de B circulantes, com base na sua especificidade BCR, seguida pela produção de plenamente humano mAbs antígeno-específicas em alto rendimento e com um tempo de rastreio de baixo. O método não está restrita a células B de memória ou pilhas de B de desegregação induzidas após uma resposta imune, mas também pode ser aplicado ao repertório B célula humana ingênua. Que funciona mesmo a partir de células B Ag específicos presentes em muito baixas frequências é uma boa indicação de sua eficiência. O princípio do método é como segue: células mononucleares de sangue periférico (PBMC) estão manchadas com dois tetrâmeros apresentando o antígeno de interesse, cada um marcado com um fluorocromo diferente (por exemplo, ficoeritrina (PE) e Allophycocyanin (APC)), e um terceiro tetrâmero apresentando um antígeno estreitamente relacionado conjugados com um fluorocromo terceiro (por exemplo, Brillant violeta 421 (BV421)). Para enriquecer para ligação de antígeno de células, as células então são incubadas com pérolas revestidas com anti-PE e Abs anti-APC e classificada em colunas de separação de células. A fração de célula APC PE+ + é selecionada, manchadas com uma variedade de mAbs específicos para diferentes tipos de células PBMC permitir a identificação de células B e sujeito a classificação de célula de citometria de fluxo. Células B, que são PE+ e APC+, mas violeta brilhante, são isoladas. Esta etapa Counter-seleciona as células que não são células B ou que não se ligam ao antígeno tetramerized, mas vincular a PE ou APC (estas células serão PE+ APCou PE APC+) ou a parte não-antígeno dos tetrâmeros usado (estas as células serão BV421+). Células B não altamente específicas para o epítopo de interesse também são Counter-Selecionadodas para esta etapa (estas células também será BV421+). Assim, este método pode purificar altamente específicas B celulas que expressam receptores de células B (BCRs) capazes de discriminar entre dois antígenos muito aparentados. Única células B específicas são colhidas em tubos e suas PCR amplificados Ig cDNAs (os ácidos desoxirribonucleico complementares) clonado e expressa por uma linhagem de células humanas como secretada mAbs IgG.

Como uma prova de conceito, este estudo descreve a geração eficiente de mAbs humana, que reconhecem um peptídeo apresentado por uma classe de complexo principal de histocompatibilidade I (MHC-eu) molécula e podem discriminar entre este peptídeo e outros peptídeos carregados na mesma MHC-eu alelo. Embora o nível de complexidade deste Ag é importante, esse método permite que (i) recuperação de alto rendimento de mAbs Ag-específicos; (ii) produção de mAbs capaz de discriminar entre dois estruturalmente fechar Ags. Esta abordagem pode ser estendida para pacientes infectados ou vacinados sem qualquer modificação do protocolo e também já foi implementada com sucesso em um rato humanizado sistema9. Assim, este estudo descreve uma abordagem versátil e eficiente para gerar mAbs totalmente humana que pode ser usado em pesquisa básica e imunoterapia.

Protocol

Todas as amostras de sangue periférico humano foram obtidas de doadores anônimos adultos após consentimento informado, em conformidade com o Comitê de ética local (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedimento PLER NTS-2016-08). 1. isolamento de células mononucleares de sangue periférico humano Nota: A partir de material pode ser sangue periférico humano total ou cytapheresis amostras. As amostras não devem ter mais de 8 h e suplementado com anti…

Representative Results

Partir de PBMC de doadores saudáveis, presentes neste projeto a geração de mAbs humana, que reconhece o peptídeo Pp65495 (Pp65, do citomegalovírus humano) apresentado pela classe complexo principal de histocompatibilidade I (MHC-eu) molécula HLA – A * 0201 ( HLA-A2). Esses mAbs podem discriminar entre este complexo e complexos que representam outros peptídeos carregados no mesmo MHC-eu molécula. PBMC foram cor…

Discussion

O protocolo proposto é um método poderoso para a geração de mAbs humano diretamente de células B Ag específicos circulantes no sangue. Ele combina três aspectos importantes: (i) a utilização de um enriquecimento magnético tetrâmero-associados, que permite um isolamento ex vivo de mesmo raras células B Ag-ligação; (ii) uma estratégia associada que usa três tetrâmeros de Ag (dois entes relevantes e um irrelevante) rotulados com três diferentes fluorochromes para isolar, por citometria de fluxo, a…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a facilidade de citometria “CytoCell” (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) por assistência técnica especializada. Agradecemos também toda a equipe de produção de proteína recombinante (P2R) e de plataformas de impacto (1232 INSERM, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) pelo apoio técnico. Agradecemos-Emmanuel Scotet e Richard Breathnach comentários construtivos sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo projecto IHU-Cesti, financiado pelo programa de governo francês «Investissements d’Avenir», gerido pelo francês nacional investigação agência (ANR) (ANR-10-IBHU-005). O projeto IHU-Cesti também é suportado pelo Nantes Métropole e Région Pays de la Loire. Este trabalho foi realizado no contexto do LabEX IGO programa apoiado pela Agência de investigação nacional, através do investimento do futuro programa ANR-11-LABX-0016-01.

Materials

HEK 293A cell line Thermo Fisher scientific R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by life technologies 21969-035 (+) 4,5g/L D-Glucose
0,11g/L Sodium Pyruvate
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X) Gibco by life technologies 31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA) PAA K45-001
Nutridoma-SP Roche 11011375001 100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 Ambion AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 Invitrogen by Life Technologies 15575-020
Fetal Bovine serum (FBS) Dominique Dutscher S1810-500
Ficoll – lymphocytes separation medium EuroBio CMSMSL01-01 density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate Invitrogen by Life Technologies S21388 premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate Invitrogen by thermoFisher scientific S32362 1mg/ml
2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin Biolegend 405225 conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor Miltenyi Biotec 130-042-302/130-090-976
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
CD3 BV510 BD horizon BD Pharmingen / BD Biosciences 563109 Used dilution 1:20
CD19 FITC BD Pharmingen / BD Biosciences 345788 Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 561116 Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 338440 Used dilution 1:50
7AAD BD Pharmingen / BD Biosciences 51-68981E (559925) Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer BD Biosciences
8-strip PCR tubes Axygen 321-10-061
Racks for 96 microtubes Dominique Dutscher 45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) Invitrogen by thermoFisher scientific 10777-019 qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free Gibco 10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer New England BioLabs S1316S 5.0 A260unit
Random hexamers Invitrogen by thermoFisher scientific N8080127 qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen by thermoFisher scientific 18080-044 qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase Promega M7805
dNTP Set, Molecular biology grade Thermo Scientific R0182 4*100umol
5LVH1 Eurofins ACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH3 Eurofins AAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVL4_6 Eurofins CCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH5 Eurofins CAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
3HuIgG_const_anti Eurofins TCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1 Eurofins GGGAATTCTCACA
GGAGACGA
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2 Eurofins ATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk3 Eurofins CTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk4 Eurofins ATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566 Eurofins GTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5 Eurofins GCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'LVl1 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl2 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl3 Eurofins GCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5 Eurofins GGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl6 Eurofins GTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl7 Eurofins GGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5LVl8 Eurofins GAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
3'Cl Eurofins CACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3 Eurofins CTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5 Eurofins CTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6 Eurofins CTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8 Eurofins CTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
3'XhoICl Eurofins CTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense Eurofins GCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC
Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade MP Bio AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate Macherey Nagel 743.100.100
Enzyme Age I HF New England Biolabs R3552L 20000U/ml
Enzyme SalI HF New England Biolabs R3138L 20000U/ml
Enzyme Xho I New England Biolabs R0146L 20000U/ml
Enzyme BSIWI New England Biolabs R0553L 10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase Invitrogen by thermoFisher scientific 15224.017 100U (1U/ul)
2X YT medium Sigma Aldrich Y1003-500ML
Ampicillin Sigma Aldrich 10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification Macherey Nagel 740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent PolyPlus 101-40
Flat bottom96-well plate Falcon 353072
V-bottom 96-well plate Nunc/Thermofisher 055142
Nunc easy 175 cm2 flasks Nunc/Thermofisher 12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer eBiosciences 00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates Nunc/Thermofisher 44-2404-21 high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) BD Pharmingen / BD Biosciences 55788
TMB substrate BD Biosciences 555214
Streptavidin Sigma S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column GE Healthcare 17-0402-01
ÄKTA FPLC GE Healthcare 18190026
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System BioRad 7880003

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Devilder, M., Moyon, M., Saulquin, X., Gautreau-Rolland, L. Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood. J. Vis. Exp. (132), e56508, doi:10.3791/56508 (2018).

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