희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성
Summary
인간의 혈액에서 회람 하는 드문 B 세포에서 시작 인간 항 체의 항 원에 대 한 특정의 생산 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 자연 항 체의 생성은 효율적이 고 신속한, 그리고 얻은 항 체 매우 관련된 항 원 사이 차별 수 있습니다.
Abstract
단일 클론 항 체 (mAbs)는 모두 근본적인 연구와 의학에 유용한 강력한 도구입니다. 그들의 높은 특이성 항 체 매우 관련된 구조 (예를 들면, 정상적인 단백질 및 그 돌연변이 버전) 사이 구별 하는 경우 필수 되지 않습니다. 같은 구별 mAbs 생성의 현재 방법은 비용과 시간이 소요 여러 Ab 생산 하는 B 세포의 광범위 한 검사를 포함 한다. 우리 제안 여기 신속 하 고 비용 효과적인 방법의 구별, 세대에 대 한 완전히 인간의 mAbs B 림프 톨을 순환 하는 인간의 혈액에서 시작 합니다. 이 전략의 독창성은 쉽게 사용할 수 있는 주변 혈액 단 세포 (PBMC)를 사용 하 여 다른 모든 셀의 카운터 선택과 결합 하는 특정 항 원 바인딩 B 세포의 선택 때문 이다. 일단 특정 B 세포 격리, 해당 mAb 코딩 하는 cDNA (보완 deoxyribonucleic acid) 시퀀스는 얻은 단일 셀 반전 전사-연쇄 반응 (RT-PCR) 기술을 사용 하 여 이후 인간의 표현 셀입니다. 1 달 만큼 적게, 내 자연스럽 게 B 셀 레 퍼 토리에 의해 감지 하는 거의 모든 원하는 항 원에 대하여 지시 하는 매우 구별 인간의 mAbs의 밀리 그램을 생산 가능 하다.
Introduction
여기 설명 하는 방법을 완벽 하 게 인간 단일 클론 항 체의 (mAbs) 원하는 항 원 (Ag)에 대 한 신속 하 고 다양 한 생산 수 있습니다. mAbs는 많은 기초 연구 응용 프로그램 체 외 및 생체 내에서필수 도구: flow cytometry, 조직학, 서 럽 고 차단 실험 예. 또한, mAbs는 사용 되 고 더 의학에서 자가 면역 질환, 암, 치료 하 고 이식 거부1제어 하. 예를 들어 안티-CTLA-4 및 안티-PD-1 (또는 반대로 PD L1) mAbs 최근 암 치료2검사점 면역 억제제로 사용 되었다.
첫 번째 mAbs 면역 글로불린 (Ig)에 의해 제작-면역된 쥐 또는 쥐의 비장 세포에서 얻은 hybridomas 은닉. 그러나, murine 또는 쥐 mAbs에 대 한 강한 면역 반응을 그들의 신속한 통관 및 과민 반응3의 가능한 유도 인 간에 있는 그들의 치료 사용을 지장을 초래할 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 mAbs의 동물성 단백질 시퀀스 부분적으로 소위 공상 마우스 인간 또는 인간 답게 된 항 체를 생성 하 인간 그들에 의해 대체 되었습니다. 그러나,이 전략 부분적 으로만 immunogenicity, 실질적으로 비용 및 시간-생산의 규모를 증가 하는 동안 감소. 인간의 mAbs 인간 B 세포에서 직접 생성 하는 고이 대 한 몇 가지 전략을 사용할 수 있습니다. 그들 중 하나 살 균 소 또는 효 모 디스플레이의 사용 이다. 이 무거운 무작위 인간의 Ig의 조합 도서관에서 변수 도메인 표시과 빛 연결에 페이지 또는 효 모, 그리고 관심의 특정 항 원을 사용 하 여 선택 단계를 수행. 이 전략의 주요 단점은 무 겁 고 가벼운 사슬은 무작위로 연결 된, 생성 된 항 체의 다양성에 아주 큰 증가에 지도입니다. 얻은 항 체 특정 Ag에 대 한 자연 면역 반응에서 발생 하는 것을 그에 해당 하는 있지 않습니다. 또한, 인간 단백질 폴딩과 포스트 번역 상 수정은 체계적으로 복제 않을 원핵생물 또는 효 모에도. 두 번째 인간 mAb 생산 방법은 엡 스타인-바 바이러스 감염이 나 안티 apoptotic 요인 BCL-6 및 BCL XL4의 식에 의해 자연 인간 B 세포 immortalization입니다. 그러나,이 메서드는 메모리 B 세포에만 적용 이며 효율적인, 수많은 mAb 생성 불멸 하 게 B 세포의 몇 가지 (해당 되는 경우) mAb 클론 원하는 항 원 특이성을 식별 하는 검사를 요구 하지 않습니다. 방법은 이렇게 비용과 시간이 소요입니다.
최근 새로운 프로토콜에서 고립 된 단 하나 B 세포5인간의 mAbs의 생산에 대 한 설명 하고있다. 그것에 최적화 된 단일 셀 반전 전사-연쇄 반응 (RT-PCR) 증폭의 두 무거운-및 빛-체인 인코딩 단일 정렬 된 B 세포에서 세그먼트에 대 한 의존 합니다. 이것 완전히 인간의 mAb의 재건 되므로 진 핵 식 시스템에 복제 하 고 이러한 세그먼트의 표현에 의해 선행 된다. 이 프로토콜은 예방 접종된 기증자에서 B 세포에서 시작 하 고 성공적으로 사용 되었습니다. 셀 B 세포는 원하는 자세에 대 한 감독의 더 높은 주파수를 가져오고 따라서6심사에 필요한 시간을 제한 하는 예방 접종 후 몇 주를 수확 했다. 다른 완전히 인간 mAbs 또한 HIV+ (인간 면역 결핍 바이러스)에 감염 된 환자7 과 흑색 종 환자8에서 제작 되었습니다. 이러한 발전에도 불구 하 고 아직도 그들의 메모리 표현 형 또는 주파수의 독립적인 Ag 특정 B 세포의 분리를 가능 하 게 사용할 수 없는 절차가입니다.
절차 설명 여기 뒤에 높은 수율 및 낮은 심사 시간 완전 인간 항 원 특정 mAbs의 생산 그들의 BCR 특이성에 따라 인간의 순환 B 세포의 효율적인 비보 전 절연 리드. 메서드를 사용 하면 메모리 B 세포 또는 항 체 은닉 B 세포는 면역 반응 후 유도에 제한 되지 않습니다 하지만 인간의 순진한 B 셀 레 퍼 토리에도 적용 될 수 있습니다. 그것은 매우 낮은 주파수에 Ag 특정 B 세포에서 시작 작동 효율성의 좋은 표시 이다. 방법의 원리는 다음과 같습니다: 주변 혈액 단 세포 (PBMC)는 관심사의 항 원을 제시 하는 2 개의 tetramers 물, 각각 다른 형광 색소 (예를 들어, Phycoerythrin (PE) 및 Allophycocyanin (APC))와 함께 표시 그리고 세 번째 형광 색소 (예를 들어, 화려한 바이올렛 421 (BV421))와 밀접 하 게 관련 된 항 원 제시 3 tetramer 활용. 항 원 바인딩 셀에 대 한 풍부 하 셀은 다음 인 큐베이 팅 구슬 안티-PE 코팅 및 안티-APC Abs, 셀 분리 열에 정렬. APC PE+ + 셀 분수 선택, mAbs PBMC 셀 종류 B 세포의 식별을 허용에 대 한 특정의 다양 한 스테인드 그리고 복종 flow cytometry 셀 정렬 합니다. B 세포는 PE+ +, 화려한 바이올렛–, 그러나 APC 격리 됩니다. 이 단계는 카운터 B 세포 또는 항 원 tetramerized에 바인딩되지 않습니다 그러나 PE 또는 APC (이 셀 것 PE+ – APC 또는 PE– APC+) 또는 사용 (이 tetramers의 비 항 원 부분에 바인딩 할 셀을 선택 셀 BV421 될 것입니다+). 이 단계에서 B 세포 높은 관심의 피토 프에 대 한 특정 카운터 선택 또한 (이 셀 BV421 됩니다+). 따라서,이 메서드는 매우 구체적인 B 세포 B 세포 수용 체 (BCRs) 두 매우 밀접 하 게 관련 된 항 원 사이 차별 있게 표현 정화 수 있습니다. 튜브에 수집 되는 단일 특정 B 세포 그들의 PCR 증폭 Ig cDNAs (보완 deoxyribonucleic 산) 복제 하 고 IgG mAbs 분 비로 인간 세포 선으로 표현.
개념의 증거로 서이 연구는 펩 티 드 제시한 중요 한 조직 적합성 복잡 한 클래스 나 인식 인간의 mAbs의 효율적인 생성에 설명 합니다 (MHC-나) 분자가 펩 티이 드와 같은에 로드 된 다른 펩 티 드 사이 차별 수 있습니다 MHC-나 대립 유전자. 이 자세의 복잡성 수준을 중요 하지만이 방법을 사용 하면 (i) Ag 관련 mAbs;의 고수익 복구 (2) 두 개의 구조적으로 가까운 Ags 사이 차별 있게 mAbs의 생산. 이 방법은 프로토콜 수정 없이 예방 접종 또는 감염 된 환자에 게 확장 될 수 있습니다 그리고 또한 이미 성공적으로 인간 답게 쥐 시스템9에서 구현 되었습니다. 따라서,이 연구는 기초 연구에 immunotherapy 사용할 수 있는 완전 인간 mAbs를 생성 하는 다양 하 고 효율적인 접근 방식을 설명 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제안 된 프로토콜 Ag 특정 B 세포는 혈액 순환에서 직접 인간의 mAbs의 세대에 대 한 강력한 방법입니다. 그것은 세 가지 중요 한 측면을 결합 한다: (i) tetramer 관련 자기 농축, 심지어 드문 Ag 바인딩 B 세포;의 비보 전 격리 수 있는의 사용 (ii)을 사용 하 여 3 Ag tetramers (2 개의 관련 것 들 그리고 한 없는 하나) 이라는 세 가지 다른 형광으로, cytometry, 여 BCR 특정 원하는 Ag;에 대 한 표현 B 셀만 제어…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 전문가 기술 지원을 위한 Cytometry 시설 “CytoCell” (SFR 건강, Biogenouest, 낭트) 감사합니다. 우리는 그들의 기술 지원에 대 한 또한 모든 직원을의 재조합 단백질 생산 (P2R) 및 영향 플랫폼 (INSERM 1232, SFR 건강, Biogenouest, 낭트)의 감사합니다. 우리에 대 한 건설적인 의견 원고 에마뉘엘 Scotet 및 리처드 Breathnach 감사합니다. 이 작품 «Investissements d’Avenir» 프랑스 정부 프로그램, 여는 프랑스 국가 연구 기관 (ANR) (ANR-10-IBHU-005) 관리에 의해 자금 IHU Cesti 프로젝트에 의해 재정적으로 지원 되었다. IHU-Cesti 프로젝트도 낭트 메트로 지구의 드 라 루아르에 의해 지원 됩니다. 이 작품은 미래의 프로그램 ANR-11-LABX-0016-01의 투자를 통해 국립 연구 기관에서 지 원하는 LabEX IGO 프로그램의 맥락에서 실현 했다.
Materials
| HEK 293A cell line | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine |
| RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | PAA | K45-001 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
| PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 | Invitrogen by Life Technologies | 15575-020 | |
| Fetal Bovine serum (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
| Ficoll – lymphocytes separation medium | EuroBio | CMSMSL01-01 | density 1,0777+/-0,001 |
| streptavidin R-phycoerythrin conjugate | Invitrogen by Life Technologies | S21388 | premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide |
| Streptavidin, allophycocyanin conjugate | Invitrogen by thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM azide premium grade |
| Brilliant violet 421 streptavidin | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
| Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| MidiMACs or QuadroMACS separotor | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Used dilution 1:20 |
| CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Used dilution 1:20 |
| CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Used dilution 1:50 |
| CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Used dilution 1:50 |
| 7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Used dilution 1:1000 |
| FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer | BD Biosciences | ||
| 8-strip PCR tubes | Axygen | 321-10-061 | |
| Racks for 96 microtubes | Dominique Dutscher | 45476 | |
| RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) | Invitrogen by thermoFisher scientific | 10777-019 | qty:5000U (40U/ul) |
| Distilled Water Dnase/Rnase Free | Gibco | 10977-035 | |
| Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
| Random hexamers | Invitrogen by thermoFisher scientific | N8080127 | qty : 50uM, 5nmoles |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 18080-044 | qty : 10000U (200U/ul) |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| dNTP Set, Molecular biology grade | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
| 5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening |
| 3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig |
| 5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 5'LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening |
| 5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1_9_1–13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening |
| Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC |
Bacteria PCR screening |
| QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade | MP Bio | AGAH0500 | |
| NucleoFast 96 PCR Plate | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
| Enzyme Age I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
| Enzyme SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
| Enzyme Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
| Enzyme BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
| HCg1 (Genbank accession number FJ475055) | |||
| LCk (Genbank accession number FJ475056 ) | |||
| LCl (Genbank accession number FJ517647) | |||
| T4 DNA ligase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
| 2X YT medium | Sigma Aldrich | Y1003-500ML | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | 10835242001 | |
| LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
| Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification | Macherey Nagel | 740588.250 | |
| Jet PEI DNA transfection reagent | PolyPlus | 101-40 | |
| Flat bottom96-well plate | Falcon | 353072 | |
| V-bottom 96-well plate | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
| Nunc easy 175 cm2 flasks | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
| ELISA/ELISPOT coating buffer | eBiosciences | 00-0044-59 | |
| Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | high protein binding |
| Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
| TMB substrate | BD Biosciences | 555214 | |
| Streptavidin | Sigma | S0677 | |
| 1 mL-HiTrap protein A HP column | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517501 | |
| NGC Quest 10 Plus Chromatography System | BioRad | 7880003 |
Riferimenti
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
- Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
- Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
- Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
- Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532 (2011).
- Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
- Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3 (2017).
- Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
- Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
- Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
- Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).
