Summary

Eine bequeme Methode für die Extraktion und Analyse mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie Katecholamin Neurotransmitter und deren Metabolite

Published: March 01, 2018
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Summary

Wir präsentieren eine bequeme Festphasen-Extraktion gekoppelt an Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit elektrochemischen Detektion (ECD) für die gleichzeitige Bestimmung von drei Monoamin-Neurotransmittern und zwei ihrer Metaboliten im Urin von Säuglingen. Wir erkennen auch der Metabolit MHPG als potenzielle Biomarker für die Früherkennung von Schädigungen des Gehirns für Kleinkinder.

Abstract

Die Extraktion und Analyse von Katecholamin Neurotransmitter in biologischen Flüssigkeiten ist von großer Bedeutung bei der Beurteilung der Funktion des Nervensystems und damit verbundenen Krankheiten, aber ihre genaue Messung ist nach wie vor eine Herausforderung. Viele Protokolle sind für die Messung der Neurotransmitter durch eine Vielzahl von Instrumenten, einschließlich Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) beschrieben worden. Allerdings gibt es Mängel, wie z. B. komplizierte Operation oder schwer zu erkennende mehrere Ziele, die nicht vermieden werden können, und derzeit die dominante Analysetechnik ist noch gepaart mit empfindlichen elektrochemische oder fluorimetrischen Erkennung durch HPLC seine hohe Empfindlichkeit und gute Selektivität. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Vorbehandlung und Erkennung von Katecholaminen mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit elektrochemischen Detektion (HPLC-ECD) in realen Urinproben von Säuglingen mit Electrospun zusammengesetzten Nanofasern komponierte beschrieben. Polymeren Krone Ether mit Polystyrol als Adsorbens auch bekannt als der Festphase verpackt-Faser-Extraktionsmethode (PFSPE). Wir zeigen, wie Urin, die Proben können leicht durch eine Nanofaser verpackt Festphase-Spalte, und wie die Analyten in der Probe schnell angereichert werden können, vorgereinigt werden desorbiert, und auf einem ECD-System erkannt. PFSPE vereinfacht die Vorbehandlung Verfahren für biologische Proben für verringerte Zeit, Kosten und die Verringerung des Verlustes der Ziele ermöglicht.

Insgesamt zeigt diese Arbeit eine einfache und bequeme Protokoll für die Festphasen-Extraktion, gekoppelt an ein HPLC-ECD-System für die gleichzeitige Bestimmung von drei Monoamin-Neurotransmitter (Dopamin (DA), Noradrenalin (NE), Adrenalin (E)) und zwei ihre Stoffwechselprodukte (3-Methoxy-4-Hydroxyphenylglycol (MHPG) und 3,4-Dihydroxy-Phenylacetic Säure (DOPAC)) im Urin von Säuglingen. Das etablierte Protokoll wurde angewandt, um die Unterschiede der Harn Katecholamine und deren Metabolite zwischen risikoreichen Säuglinge mit perinatalen Hirnschäden und gesunden Kontrollpersonen zu beurteilen. Vergleichende Analyse ergab einen signifikanten Unterschied im Harn MHPG zwischen den beiden Gruppen, die darauf hinweist, dass die Katecholamin-Metaboliten ein wichtiger Kandidat Marker zur Früherkennung von Fällen für Hirnschäden bei Säuglingen gefährdet sein können.

Introduction

Katecholamin Neurotransmitter und deren Metaboliten Inhalte in Körperflüssigkeiten können neuronale Funktion beeinflussen und Auswirkungen auf das Gleichgewicht der Reaktion auf Anregung Staaten zu einem großen Teil1. Abnormities kann dazu führen, dass eine Vielzahl von Krankheiten, z. B. Ganglioneuroma, Pheochromacytoma, Neuroblastom und neurologischen Störungen1,2. Extraktion und Bestimmung der Katecholamine in Körperflüssigkeiten ist sinnvoll, die Diagnose der relevanten Krankheiten. Jedoch gibt es in geringen Konzentrationen Katecholamine in biologischen Proben und leicht oxidierbar. Darüber hinaus sind sie sehr schwierig, wegen der großen Menge der Einmischung in die mittleren3eluieren. Simultane Detektion von Katecholaminen in biologischen Flüssigkeiten ist somit nach wie vor eine Herausforderung.

Es wurden Bewertungen zeigen, dass Harn Katecholamine ein gewisses Maß an Stress sein können und ihre Ebenen sind wichtige biologische Marker reagieren auf taktile Stimulation, die Verarbeitung in Neugeborenen-5. Den Untersuchungen zufolge alle Kinder, die von der vorzeitigen Vorfälle litten sind mit einem Risiko für Gehirn Verletzungen4,5,6, und abnorme Freisetzung von Katecholaminen und damit zusammenhängende Fragen in den Flüssigkeiten kann zu Verletzungen führen. Es gibt erweiterte Magnet-Resonanz-Techniken, die Schädigung des Gehirns in früheren Phasen7,8erkennen können. Jedoch innerhalb der ersten 48 h verursacht ein abnorme Neurodevelopmental Prozess permanent-Hirn-Trauma, das zeigt sich in medizinische Bilder11wird nicht. Außerdem hohe Kosten und knappen Instrument Ressourcen, zusammen mit anderen Faktoren macht es unmöglich für alle Neugeborenen Einheiten Zugriff auf diese speziellen Neuro-Imaging-Techniken zu. Jedoch die Verwendung von eine leicht zugängliche und praktische Biomarker (z.B. Katecholamine und deren Metabolite) konnte diese Mängel überwinden, und die Vorführung eines Biomarkers in menschlichen Flüssigkeiten kann helfen bei der Früherkennung von Hirn-Trauma und führen zu veranlassen Kennung des Neugeborenen benötigen Neuroprotektion9. Die Katecholamine im Urin können ein einfach und klar Index durch die direkte Korrelation zwischen der Höhe der ihnen in Flüssigkeiten und Neuroactivity Funktion freigegeben sein.

Unter biologischen Flüssigkeiten, zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) und Plasma-Proben sind nicht leicht zu bekommen über bestehenden traumatische Verfahren, und es ist auch sehr schwer loszuwerden, Störungen durch Klebstoff Protein und andere Verunreinigungen, führt zu einer lästigen und zeitraubende Probenahme Prozess, für wiederholte Erkennung ungeeignet ist. Auch für Kinder ist es fast unmöglich, die Proben auf traumatische Weise zu bekommen. Harn Probenahme deshalb besser als die anderen Formen der Probenahme, wie es ist, nicht-invasive, einfach zu bedienen, und kann immer wieder durchgeführt werden. Urinproben sind reichlich vorhanden und leicht zu verstauen, und zeigen große Vorteile gegenüber anderen Formen der biologischen Proben.

Die wichtigsten Methoden zur Quantifizierung von Katecholaminen in biologischen Flüssigkeiten gehören Radioenzymic Assays10, Enzym-linked immun-sorbent Assays11, Voltammetrie12 und thermische Linse Spektrometrie13. Aber Mängel vorhanden sind, wie z. B. komplizierte Vorgänge und schwer zu erkennende mehrere Ziele. Heute ist die dominierende Analyseverfahren Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)14, gepaart mit sensiblen elektrochemische15 oder fluorimetrischen Erkennung16, wegen seiner hohen Empfindlichkeit und gute Selektivität. Mit Tandem-Massenspektrometrie Technologie, wie flüssige Chromatographie/Massenspektrometrie (LC/MS) und flüssige Chromatographie/Masse Spektrometrie/Massenspektrometrie (LC/MS/MS), die Analyse und Quantifizierung der Neurotransmitter erreichen hohe Genauigkeit und Spezifität17,18. Der MS-Technik erfordert jedoch teuer Instrumentierung sowie wesentlich qualifizierte Arbeitskräfte, erschwert die Methode allgemein in den meisten herkömmlichen Labors anzuwenden. HPLC-ECD-Systeme sind häufig in konventionellen und klinischen Laboratorien ausgestattet und haben somit eine gemeinsame und gute Wahl für Forschungsgruppen für chemische Bestimmung verwenden, aber sie erfordern die Probe eingeführt in das System sauber zu sein und der Microscale Volumen19. Daher ist es von großer Bedeutung, zu reinigen und die Probe vor der Analyse zu kondensieren. Die klassische Methode für den Reinigungsschritt ist flüssig-flüssig-Extraktion14,15,20 und off-line Festphasen-Extraktion, einschließlich aktivierte Tonerde Spalte21,22 und Diphenylborate (DPBA) Komplexierung23,24,25,26.

Myeongho Lee Et al. haben chemisch modifiziert mit Krone Äther als das Adsorbens Polymer-Harz verwendet, um selektiv Katecholamine aus menschlicher Urin seit 200727zu extrahieren. Auch in 2006 Haibo He Et Al. bewies eine einfache Synthese für Boronate Affinität Extraktion Sorbens Byutilizing ein functionalizable Nanomagnetische polyedrischen Oligomere Silsesquioxane (POSS) auf der Grundlage Nanomagnetische Composite und zur Bereicherung der Katecholamine in Anwendung menschlicher Urin (Noradrenalin, Adrenalin und Isoprenalin)28. Sie nutzte die Gelegenheit der Nanomaterialien, die Arbeit mit einer Technologie namens Nano-Elektrospinnen und bilden das Polymer Fasermaterial im Nanobereich zu erfüllen. Elektrospinnen Prozess kann der Durchmesser, die Morphologie und die räumliche Ausrichtung des Produktes anpassen, durch die Steuerung der Arbeitsspannung und Änderung des Inhalts der Spinnlösung zusammen mit anderen Parametern29. Im Vergleich mit der konventionellen SPE Patrone, Electrospun Nanofasern eignen sich hervorragend zu extrahieren und zu bereichern Ziel Analyten aus einer komplexen Matrix, da sie mit hoher Oberfläche-Bereich-zu-Volumen-Verhältnis ausgestattet sind, um die Analyten mit hohem Wirkungsgrad zu adsorbieren und weisen Sie mehr leicht kontrolliert Oberfläche chemische Eigenschaften auf, so dass praktische Befestigung der Ziel-Verbindungen. Diese Eigenschaften machen sie gute Möglichkeiten für SPE Adsorbentien, reduziert die feste Phase und Desorption Lösungsmittel Betrag30,31,32,33. Für Katecholamine in Urinproben wurden Electrospun Nanofasern bestehend aus Apolymeric Krone Äther mit Polystyrol (PCE-PS) verwendet, um gezielt drei Katecholamine (“NE”, “E” und “DA”)34extrahieren. Das Papier darauf hingewiesen, dass die selektive Krone Äther die Ziele von NE, E, und DA, basierend auf seine korrekte Geometrie zum Binden von Katecholaminen adsorbiert über Wasserstoffbrückenbindungen bilden. Die Ergebnisse angezeigt den materiellen Krone Äther effektiv entfernen andere störenden Verbindungen enthalten in biologischen Proben. Inspiriert von diesem Bericht, wurde eine neuartige Methode für den selektiven Abbau der Katecholamine durch Verwendung von Electrospun zusammengesetzte Nanofasern bestehend aus PCE-PS entwickelt

In diesem Papier berichtet die Methode bisher34 wurde verbessert und beschäftigt nicht nur um E, NE, und DA, sondern auch deren Metaboliten, MHPG und DOPAC, im Urin erfolgreich analysieren. Auch Möglichkeiten neue für den Mechanismus der Adsorption-Prozess. Die Methode zeigt befriedigende Extraktionseffizienz und Selektivität für die fünf Analyten, und die Methode wurde in der Analyse des Urins von risikoreichen Säuglinge mit perinatalen Hirnschäden und gesunden Kontrollen überprüft.

Protocol

Einwilligung der Eltern war, und institutionelle Review Board Genehmigung wurde für die Studie. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Code of Ethics der World Medical Association (Declaration of Helsinki) für Experimente mit Menschen durchgeführt. Pflegende Angehörige von allen Teilnehmern zur Verfügung gestellt schriftliche Zustimmung für sein in die Studie aufgenommen. Ethikkommission Genehmigung von Zhongda Krankenhaus, affiliate mit Southeast University, wurde auch gewonnen. 1. …

Representative Results

Dieses Protokoll ist eine einfache und bequeme PFSPE Methode zum Vorbehandeln Urinproben und bereichern fünf Katecholamine zur Erkennung über ein HPLC-ECD-System; eine Abbildung des Prozesses ist in Abbildung 1dargestellt. Das Protokoll enthält hauptsächlich vier Schritte aktivieren, laden, spülen, und eluting – gepaart mit einer kleinen Menge von PCE-PS Nanofasern und einem einfachen Festphasen-Extraktion-Gerät. Die Morphologie der PCE-PS Nanofasern wu…

Discussion

Die vorgeschlagene PFSPE-Methode in diesem Artikel möglicherweise erhebliche und aussagekräftig in Bezug auf seine Schnelligkeit, Einfachheit und Bequemlichkeit. Die Adsorbentien im Protokoll verwendet werden Electrospun Nanofasern, die hohe Oberfläche Bereich-zu-Volumen-Verhältnis und der Analyten mit hohem Wirkungsgrad zu adsorbieren. Die Prozedur nur braucht ein paar Milligramm Nanofaser und ein kleines Volumen des Lösungsmittels Fließmittel und erfordert keinen Verdunstung Schritt Analyten zu konzentrieren. Hie…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde unterstützt durch die National Science Foundation of China (No.81172720, Nr. 81673230), die soziale Entwicklung Forschung Programm der Jiangsu Provinz Wissenschaft und IT-Abteilung (Nr. BE2016741), Wissenschaft & Technologie-Projekt der China General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine (2015QK055), das geöffnete Projekt Programm der Key Laboratory der kindlichen Entwicklung und das Lernen des Ministeriums für Bildung, Wissenschaft Southeast University (CDLS-2016-04). Wir erkennen mit freundlichen Grüßen Yuan Song und Ping Liu, die uns in Proben Sammlung unterstützt.

Materials

200 µL pipette tip column to contain nanofibers
PCE-PS nanofibers material for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter) fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml) compress solution into the end of the tip
methanol Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) Sigma-Aldrich.Inc A-106408 complex reagent
norepinephrine(NE) Sigma-Aldrich.Inc A-9512 analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) Sigma-Aldrich.Inc H1377 analyte
epinephrine(E) Sigma-Aldrich.Inc 100154-200503 analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) Sigma-Aldrich.Inc D-9128 analyte
dopamine(DA) Sigma-Aldrich.Inc H-8502 analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) Sigma-Aldrich.Inc 858781 interior label
acetonitrile Sigma-Aldrich.Inc 75-05-8 eluriant and mobile phase
phosphoric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7664-38-2 eluriant
uric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 69-93-2 artifical urine
creatinine Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 60-27-5 artifical urine
trisodium citrate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 6132-04-3 artifical urine
KCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7447-40-7 artifical urine
NH4Cl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 12125-02-9 artifical urine
NaHCO3 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd SWC0140326 artifical urine
C2Na2O4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 62-76-0 artifical urine
NaSO4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7757-82-6 artifical urine
disodium hydrogen phosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10039-32-4 artifical urine
urea Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 57-13-6 artifical urine
NaCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-14-5 artifical urine
MgSO4.7H2O Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10034-99-8 artifical urine
CaCl2 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10035-04-8 artifical urine
HCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-01-0 artifical urine
citric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 77-92-9 artifical urine and mobile phase
EDTA disodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 34124-14-6 mobile phase
monometallic sodium orthophosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7558-80-7 artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 22767-50-6 mobile phase
sodium hydroxide Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 1310-73-2 mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column) Aglilent 12102018 PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column Dikma 5020-06731 HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER Shimadzu Corporation, Japan SIL-20AC auto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation, Japan LC-20AD HPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector Shimadzu Corporation, Japan L-ECD-60A detector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System Micromeritics, USA surface and porosity analyzer 

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Citazione di questo articolo
Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L., Kang, X. A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites. J. Vis. Exp. (133), e56445, doi:10.3791/56445 (2018).

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