Это издание описывает изготовление орган на чипе устройства с интегрированной электродами для прямого количественного определения трансэндотелиальной электрического сопротивления (Тир). Для проверки blood – brain барьер был подражал внутри этого microfluidic устройства и контролировать ее барьерные функции. Представленные методы интеграции электрода и прямой ТЕЕР количественной оценки обычно применяются.
Органов на чипов, в пробирке модели с участием культуры ткани (человека) внутри microfluidic приборы, являются быстро возникающих и обещание предоставить полезные исследования инструменты для изучения человеческого здоровья и болезни. Характеризовать барьерной функции слоев клеток, культивированный внутри устройства орган на чипе, измеряется часто трансэндотелиальной или transepithelial электрическое сопротивление (Тир). С этой целью электродов обычно интегрированы в чип микрообработка методами, чтобы обеспечить более стабильные измерения, чем достигается с ручной вставки электродов в отверстия чипа. Однако эти электроды часто препятствуют визуальный осмотр слоя клеток изучены или требуют дорогих чистых процессов для изготовления. Чтобы преодолеть эти ограничения, устройство, описанное здесь содержит четыре легко интегрируется электродов, которые размещаются и фиксированной вне области культуры, возможность визуального осмотра. Используя эти четыре электрода, что сопротивление шести путей измерения может быть определена количественно, из которого ТЕЕР могут быть непосредственно изолированы, независимо от сопротивления микроканалов заполненные питательной среды. Blood – brain барьер был повторен в это устройство и его ТЕЕР контролируется Показать устройства применимость. Этот чип, интегрированный электродов и метод определения ТЕЕР обычно применяются в органы на фишки, чтобы имитировать других органов или быть включены в существующие системы орган на чипе.
Органов на чипы быстро становится новым и перспективным класса в vitro ткани модели. 1 в этих моделях, клетки культивировали внутри microfluidic приборы, которые разработаны таким образом, что они имитируют физиологические микроокружения этих клеток. 1 , 2 это приводит к более реалистичным физиологических и патологических поведение этих клеток, чем можно ожидать от обычных в vitro модели простой дизайн и основные функции. 3 , 5 , 6 Кроме того, органы на чипы обеспечивают более управляемой среде, чем в естественных условиях модели и может включать здоровые и больные ткани от человеческого происхождения для точно повторяют человеческой физиологии и патологии. Недавно кратко успехи в развитии крови – мозг барьеров на микросхемах (BBBs на чипов) показывают, что поле является быстро двигаться вперед. 7
Еще одним преимуществом органов на чипов является, что они позволяют в реальном времени и непрерывный мониторинг ткани, культивированный внутри устройства, микроскопия, он-лайн биохимические анализы и интегрированных датчиков. 1 , 2 например, измерения электрического сопротивления трансэндотелиальной или transepithelial (ТЕЕР) является мощным методом для мониторинга неинвазивно развитие и нарушение формирования барьера тканей. 8 , 9 , 10 ТЕЕР электрическое сопротивление через сотовый барьер и поэтому свидетельствует о целостности барьер и проницаемости. 10 в органы на фишки, клеточных барьеров являются обычно выращиваются на мембрану, разделяющую два аэрогидродинамических каналы, представляющие апикальной и базолатеральной отсеков ткани, что барьер. В таких чипов ТЕЕР измерения могут проводиться удобно с электродами, вставляется в впуски и выпуски двух каналов. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 однако, руководство вставки и реинтеграции электродов может легко привести в размещение ошибки и таким образом вариации в измеренного сопротивления как например различия в сопротивление длиннее или короче пути через микроканалов являются значительным по сравнению с сопротивление клетки барьер. 16 для устранения ошибки реинтеграции, устройств с интегрированной электроды были предложены. Однако, большинство этих комплексных электродов блокировать мнение при осмотре культуры ткани17,18,19,20,21 и/или требуют специализированных Cleanroom процессы для изготовления. 17 , 22
Орган на чипе устройства, описанные в настоящем издании, впервые применена в более ранние публикации,16 сочетает в себе устойчивость комплексной электродов с видимость слоя измеряемой клеток и легко изготовления. Проектирование и изготовление чип изображен на рисунке 1. Короче говоря, это устройство состоит из двух частей полидиметилсилоксан (PDMS) с отметками канала, которые связаны вместе бесплатно утечки с мембраной из поликарбоната с 0,4 мкм поры между ними. Четыре провода платины электроды вставляются и фиксированной на место с стеклоиономерным клей хорошо вне области культуры. Все эти шаги производства могут проводиться с Общелабораторное оборудование, без необходимости для чистых помещений среды. Помимо этого, можно сделать шесть измерений импеданса с использованием этих четырех электродов, тем самым позволяя прямой изоляции измеренных ТЕЕР, независимо от сопротивления микроканалов до поперечного сечения и таким образом свести к минимуму влияние -биологические вариации в системе, такие как (пере) ошибки вставки. 16
Чтобы показать применимость этого устройства и прямые измерения ТЕЕР, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) была воспроизведена в этот чип. Эта биологическая барьер состоит из специализированных эндотелиальных клеток и регулирует транспорт между кровью и мозг для обеспечения гомеостаза головного мозга. 23 , 24 для имитации BBB, верхний канал microfluidic устройства был выстроен с человеческого мозга микрососудистой эндотелиальных клеток от линии hCMEC/D3 клеток (любезно предоставил д -р P.-O. Couraud, INSERM, Париж, Франция). 25 представлен метод, однако, более вообще применимо к любому устройству орган на чипе с двумя отсеками, позволяя ТЕЕР определения с помощью легко интегрированы электродов.
В этой рукописи сначала описан процесс изготовления устройства орган на чипе с интегрированной электродов. Далее, посева процедуры и культуры эндотелиальных клеток мозга внутри устройства объясняется, а также на чипе ТЕЕР измерения. В разделе результаты представителя ТЕЕР измерений показываются и уточнить обработки данных. Наконец представлен барьерной функции BBB-на чипе, наблюдение в течение 3 дней, показаны применимость представленных устройств и методов для мониторинга ТЕЕР.
В этой рукописи были представлены инженерные устройства орган на чипе и непосредственного определения трансэндотелиальной электрического сопротивления (ТЕЕР) сотовых барьера, культивируемых в устройстве. Представленным методом интеграции электроды без оборудования чистых помещений и непосредственного определения ТЕЕР, используя четыре электрода применима к любой орган на чипе устройства с двумя отсеками microfluidic. Чип макет и геометрии могут быть адаптированы в соответствии с требованиями предусмотрено экспериментов, как четыре электрода отделены в двух отсеков. Четыре электрода может даже быть удобно вставлен в бухтах существующих чипов, при том условии, что они помешаны на месте в течение шести измерениям. Утечки Бесплатная связь метод могут быть оптимизированы для различных мембран и геометрии канала, изменяя соотношение PDMS/толуола. Более высокое содержание толуол приводит тоньше спин покрытием слой раствора26 и может быть более подходящим для резкости и узкие каналы в частях PDMS. Нижняя толуол контента результаты в толще mortar слой26 и может быть более подходящим подложить толще мембраны между частями PDMS.
Как можно увидеть в схематических импеданс спектры в рисунке 2A и экспериментальные спектры в рисунке 2E и 2F, измерения импеданса находятся под влиянием двойной слой емкость на интерфейсе электрод средний. Из-за небольшого размера электродов внутри микроканалов двойной слой емкость может доминировать над плато резистивный сотовой барьера в спектров импеданса, осложняющих количественная оценка ТЕЕР. Чтобы преодолеть это, могут быть вставлены электроды дальше в культуре каналы до фиксации. Это позволит увеличить площадь поверхности электрода подвергаются питательной среды и с этим емкость двойной слой будет увеличиваться также. Это приводит к сдвиг емкостным склона для низких частот, так что резистивный плато сотовой барьер может быть более легко признанных и количественные. Хотя сопротивление измеренных путь между двумя электродами станет меньше, это не будет влиять ТЕЕР количественной оценки представленных метода.
Во время измерения через сотовый барьер, вполне возможно, что загородный резистивный плато не могут быть признаны. Это может быть результатом аэрогидродинамических соединения между двумя каналами, например если мембрана плохо окружен раствор, приводит к измеренной путь вокруг сотовой барьер. Кроме того может существовать электрические преодоление вне чип, если электроды соединены капли питательной среды. Это обычно сочетается с нижней измеренное сопротивление и может быть решена путем удаления этот мост питательной среды. Наконец если существует не резистивный плато и измеренное сопротивление порядков выше, чем ожидалось, может быть свободно подключение электропроводки или в источнике питания.
В будущем физиологические актуальности текущей BBB-на чипе может быть увеличен путем разоблачения эндотелиальных клеток для сдвига стресс на физиологическом уровне, который сообщается содействовать BBB дифференциации и увеличение герметичности барьер и трудно достичь в обычных в vitro моделей. 29 Кроме того, дно канала представлены устройства обеспечивает подходящую отсек для клеток мозга, полученных совместно культивируемых с эндотелия. Это также ожидается увеличение функцию барьера, а также позволяет изучение сложных взаимодействий между типы соответствующих клеток в патологических условиях. 29
В заключение орган на чипе устройства, описанные в настоящем издании могут быть изготовлены с использованием стандартного лабораторного оборудования и показано для предоставления прямых измерений ТЕЕР, используя четыре комплексных электроды, не препятствующих визуальный осмотр изучал ячейки слой. Применимость этого устройства в поле органов на чипов была продемонстрирована подражая BBB в этот чип и мониторинга ТЕЕР период культуры. Целый ряд других органов (барьер) можно имитировать, включая другие типы соответствующих клеток в этот чип. Кроме того метод для измерения ТЕЕР может легко применяться в других двух устройств на базе купе орган на чипе прибыть на воспроизводимость и значимые ТЕЕР значений, которые можно сравнить с устройствами и системами.
The authors have nothing to disclose.
Мы с благодарностью признаем Johan Бомер для изготовления формы и Mathijs собственности для плодотворных дискуссий и помощь с представлением данных.
Это исследование финансировалось: СРО биомедицинских микроприборов л.и. Segerink, MIRA института биомедицинской инженерии и технические медицины, Университет Твенте; СРО органов на чипов, а.д. ван дер Меер, мира институт биомедицинской инженерии и технические медицины, Университет Твенте; и VESCEL, передовых грантов ЕИС к а. ван ден Берг (Грант № 669768).
Materials | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
Scotch Magic tape | 3M | ||
Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Oven | Binder | 9010-0190 | |
Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Incubator | Binder | CB E2 150 | |
Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |