이 간행물 transendothelial 전기 저항 (TEER)의 직접 정량화에 대 한 통합 된 전극 가진 기관-온-칩 소자의 제작을 설명합니다. 유효성 검사, 혈액-뇌 장벽 안쪽이 미세 장치 유사 했다 및 장벽 기능 모니터링 했습니다. 전극 통합 및 직접 TEER 정량화에 대 한 제시 방법 일반적으로 적용 됩니다.
장기에 칩, 생체 외에서 모델 미세 장치 내부 (인간의) 조직 문화를 포함는 급속 하 게 신흥 및 유용한 제공 하기 위해 약속 연구 공부 하는 인간의 건강 및 질병에 대 한 도구. 기관-온-칩 장치 안으로 경작 하는 세포 층의 장벽 기능 특성, 종종 transendothelial 또는 transepithelial 전기 저항 (TEER) 측정 됩니다. 이 위해, 전극 보통 칩의 후미에 전극의 수동 삽입 달성 보다 더 안정적인 측정을 제공 하 여 미세 칩에 통합 됩니다. 그러나, 이러한 전극 자주 공부 셀 층의 육안 검사를 방해 하거나 비싼 클린 프로세스 제작에 대 한 필요. 이러한 한계를 극복 하기 위해 여기에 설명 된 장치 배치 하 고 시각적 검사를 가능 하 게 하는 문화 영역 외부 고정 4 쉽게 통합된 전극을 포함 되어 있습니다. TEER 고립 될 수 있다 직접, 문화 매체 가득 microchannels 저항의 독립적인 6 측정 경로 저항 양이 정해질 수 있다,이 4 개의 전극에 사용 하 여. 혈액-뇌 장벽 했다이 장치에 복제 하 고 그 TEER 표시 장치 적용을 모니터링 했습니다. 이 칩, 통합된 전극 및 TEER 결정 방법 장기에 칩, 다른 장기를 모방 하거나 기존의 기관-온-칩 시스템에 통합 될 수 있는 일반적으로 적용 됩니다.
장기에 칩 빠르게 새로운 급부상 하 고 유망한 생체 외에서 의 클래스 조직 모델. 1 이러한 모델에서 셀 교양 그들은 그 세포의 생리 적인 microenvironment을 모방 하는 방식으로 설계 하는 미세 장치 내부. 1 , 2 결과 그 셀의 현실적 생리 적 또는 병 적인 동작 보다 기존의 생체 외에서 모델의 단순한 설계 및 기본적인 기능에서 예상 될 수 있다. 3 , 5 , 6 또한, 장기에 칩 비보에 모델 보다 더 나은 제어 환경을 제공 하 고 인간의 생리와 병 리를 충실 하 게 복제 인간의 기원에서 모두 건강 하 고 병에 걸린 조직을 통합할 수 있습니다. 칩 (BBBs에 칩)에 혈액-뇌 장벽을 개발에 최근 요약된 발전 분야는 신속 하 게 이동 앞으로 보여줍니다. 7
장기에 칩의 또 다른 장점은 조직 현미경 검사 법, 온라인 생 화 확 적인 분석 그리고 통합된 센서 장치 내부에 교양의 실시간 연속 모니터링 수 있다는. 1 , 2 예, 비 접촉 개발 모니터링을 위한 강력한 방법 이다 transendothelial 또는 transepithelial 전기 저항 (TEER) 측정 및 장벽 형성의 조직. 8 , 9 , 10 TEER 전기 저항 세포 장벽을 가로질러 이며 따라서 장벽 무결성 및 침투성을 나타내는 있습니다. 10 장기에 칩, 세포 장벽 일반적으로 교양 두 대표는 꼭대기 유체 채널 및 그 장벽 조직의 basolateral 구획을 구분 하는 막에. 이러한 칩 TEER 측정 후미와 2 채널의 콘센트에 삽입 된 전극으로 편리 하 게 수행할 수 있습니다. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 그러나 15 , 수동 삽입 및 전극의 재 투입 될 수 있습니다 쉽게 배치 오류에 따라서 예를 들면 으로 측정 된 저항 변화에 microchannels 통해 긴 또는 짧은 경로 저항 차이 중요 한에 비해 셀 장벽 저항. 16 reinsertion 오류를 제거 하려면 통합된 전극 장치 제안 되었습니다. 그러나,이 통합 된 전극의 대부분 조직 문화17,,1819,20,21 을 검사 하는 경우는 보기 차단 및 필요 전문 클린 룸 제작에 대 한 처리합니다. 17 , 22
이전 간행물,16 에 처음 적용 하는이 책에서 설명한 장기-온-칩 장치 측정된 셀 레이어 및 쉬운 제작에 시정 통합된 전극의 안정성을 결합 합니다. 설계 및이 칩의 제조는 그림 1에 묘사 된다. 즉,이 장치 부품 이루어져 있다 2입니다 (PDMS) 함께 결합 채널 인쇄물과 0.4와 폴 리 카보 네이트 막으로 누설 무료 µ m 모 공 사이. 4 개의 백 금 철사 전극 삽입 되 고는 photocurable와 함께 제자리에 고정 문화 영역 외부에 잘 접착. 모든 제작 단계 일반 실험실 장비, 클린 룸 환경에 대 한 필요 없이 수행할 수 있습니다. 또한, 6 임피던스 측정을 수행할 수 있습니다 microchannels 횡단면을 고의 영향을 최소화의 저항의 독립적인 측정된 TEER의 직접 격리 하므로 이러한 4 개의 전극를 사용 하 여 (재) 삽입 오류와 같은 시스템에서 비 생물 유사. 16
이 장치와 직접 TEER 측정의 적용을 보여, 혈액-뇌 장벽 (BBB)이이 칩에서 복제 되었다. 이 생물 학적 장벽이 전문된 내 피 세포의 구성 되어 있으며 혈액과 뇌 항상성 제공 하는 뇌 간의 전송 규제. 23 , 24 BBB 모방, 미세 소자의 맨 위 채널은 줄지어 (친절 하 게 제공 박사 P. o. hCMEC/D3 셀 라인에서 인간의 대뇌 microvascular 내 피 세포 Couraud, INSERM, 파리, 프랑스). 그러나 25 제시 방법은,, 더 일반적으로 두 개의 구획 어떤 기관-온-칩을 적용, 직접 TEER 결정을 쉽게 사용 하 여 활성화 통합 전극.
이 원고에서 먼저 통합된 전극 가진 기관-온-칩 소자의 제조 과정은 설명 되어 있습니다. 온 칩 TEER 측정 뿐만 아니라 다음, 시드 절차와 장치 내부에 뇌 내 피 세포의 문화 설명 된다. 결과 섹션에서 대표 TEER 측정 표시 하 고 데이터 처리를 명확히. 마지막으로,는 BBB-온-칩, 3 일 동안 모니터링의 장벽 기능 제공 됩니다, 표시 장치 및 TEER 모니터링 하는 방법의 적용을 보여주는.
이 원고는 기관-온-칩 소자의 엔지니어링 및 장치에 배양 세포 방 벽의 transendothelial 전기 저항 (TEER)의 직접적인 결정 발표 됐다. 크린 룸 장비 및 4 개의 전극을 사용 하 여 직접 TEER 결정 없이 전극 통합의 제시 방법 두 미세 구획 어떤 기관-온-칩 장치에 적용 됩니다. 2 개의 구획에 4 개의 전극 분리로 칩 레이아웃 및 형상이 상상된 실험의 요구 사항에 맞게 적용할 수 있습니다. 4 전극 수도 편리 하 게 삽입 기존 칩의 후미에는 그들은 6 측정 기간에 대 한 장소에 집착 하 고 있다. 누설 없는 접합 방법은 PDMS/톨루엔 비율을 변경 하 여 다른 세포 막 및 채널 형상에 대 한 최적화할 수 있습니다. 더 높은 톨루엔 콘텐츠 박격포26 의 얇은 스핀 코팅 층에 결과 및 더 얕은 및 좁은 채널 PDMS 부품에 적합 있을 수 있습니다. 더 두꺼운 박격포의 낮은 톨루엔 콘텐츠 결과26 레이어 고 PDMS 부품 사이의 두꺼운 막을 묶는 데 더 적합할 수 있습니다.
그림 2A 에서 도식 임피던스 스펙트럼 및 그림 2E 와 2F에실험 스펙트럼에서 볼 수 있듯이 임피던스 측정 전극 매체 인터페이스에서 더블 레이어 커패시턴스에 의해 영향을 받습니다. microchannels 내부 전극의 작은 크기로 인해 더블 레이어 커패시턴스는 TEER의 정량화를 복잡 하 게 임피던스 스펙트럼에 세포 벽의 저항 고원 위에 지배할 수 있습니다. 이 극복 하기 위해 전극 삽입 될 수 있다 고정 하기 전에 문화 채널에 추가. 이것은 노출 하는 전극의 표면적을 증가 더블 레이어 커패시턴스 뿐만 증가 문화 매체와 그. 이 결과 용량 성 기울기의 변화에 더 낮은 주파수, 세포 벽의 저항 고원 보다 쉽게 인식 하 고 정량 될 수 있도록 었 어 요. 두 개의 전극 사이 측정된 경로의 저항 작은 될 것입니다, 하지만이 하지 제시 방법을 TEER 정량화를 좌우할 것 이다.
세포 장벽을 통해 측정 하는 동안 추가 저항 고원 인식 될 수 없다 가능 하다. 이 예 막 제대로 묶인는 박격포에 의해 세포 장벽 주위에 측정 된 경로에 지도 하는 경우 두 채널 사이의 유체 연결의 결과일 수 있습니다. 또한, 거기 수 전극 문화 매체의 물방울에 의해 연결 되어 있는 경우 칩 외부 전기 브리징. 이것은 일반적으로 낮은 측정 된 임피던스와 결합 하 고 문화 매체의이 다리를 제거 하 여 해결할 수 있습니다. 마지막으로, 거기는 아무 저항 측정 된 임피던스의 크기 순서는 예상 보다 높은 경우 또는 전원에 전기 배선에서 느슨한 연결 수 있습니다.
미래에 현재 BBB-온-칩의 생리 적인 관련성 전단 BBB 차별화 및 증가 장벽 압박감을 증진에 보고 하 고 달성 하기 어렵다 생리 적 수준에서 스트레스를 내 피 세포를 노출 하 여 증가 될 수 있다 기존의 생체 외에서 모델. 29 또한, 제시 장치의 하단 채널 endothelium와 공동 경작 수를 두뇌 파생 셀에 대 한 적합 한 구획을 제공 합니다. 이것 또한 장벽 기능을 증가할 것으로 예상 하 고 또한 병 적인 조건 하에서 관련 세포 유형 사이 복잡 한 상호 작용의 연구를 수 있습니다. 29
결론적으로,이 책에서 설명한 장기-온-칩 장치 표준 실험실 장비를 사용 하 여 날조 될 수 있다 고 공부 셀의 시각적 검사를 방해 하지 않는 4 개의 통합 된 전극을 사용 하 여 직접 TEER 측정을 제공 하는 표시 됩니다. 레이어입니다. 이 장치 기관에 칩 분야에서의 적용이이 칩에 BBB를 흉내 낸는 TEER 문화 기간 동안 모니터링을 시연 했다. 다른 (장벽) 장기의 호스트는이 칩에 다른 관련 셀 종류를 포함 하 여 유사 수 있습니다. 또한, TEER 측정 하는 방법은 다른 두 구획 기반 기관-온-칩 장치를 장치 및 시스템에 비해 사용할 수 있는 재현 하 고 의미 있는 TEER 값에 도착에 쉽게 적용할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 기꺼이 유익한 토론 및 지원 데이터 표현에 대 한 금형 및 Mathijs 브 롱 호스트의 제조에 Johan Bomer 인정합니다.
이 연구에 의해 투자 되었다: SRO 의치 렌 L.I. Segerink, 미 라 연구소의 생명 공학 및 기술 의학, Twente의 대학; SRO 기관-에-칩 광고 판 데르 Meer, 미 라 연구소의 생명 공학 및 기술 의학, Twente의 대학; 그리고 VESCEL, ERC 고급 부여 A. 반 덴 베 르 그 (보조금 번호 669768).
Materials | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
Scotch Magic tape | 3M | ||
Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Oven | Binder | 9010-0190 | |
Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Incubator | Binder | CB E2 150 | |
Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |