Summary

Preparación de muestras para análisis de Endopeptidomic en el líquido cefalorraquídeo humano

Published: December 04, 2017
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Summary

Se presenta un método para el análisis de espectrometría de masa de péptidos endógenos en humanos del líquido cerebroespinal (CFS). Por medio de filtración de corte de peso molecular, fraccionamiento la cromatografía, análisis de espectrometría de masa y una posterior combinación de estrategias de identificación de péptidos, fue posible ampliar la peptidome CSF conocido casi diez veces en comparación con a estudios previos.

Abstract

Este protocolo describe un método para identificar péptidos endógenos en humanos del líquido cerebroespinal (CFS). Para ello, un método previamente desarrollado basado en la filtración de peso molecular (MWCO) de corte y análisis de espectrometría de masa fue combinado con un paso de fraccionamiento la HPLC fase inversa de alto pH fuera de línea.

Secreción en LCR es la principal vía para la eliminación de moléculas de arrojar por las células del sistema nervioso central. Así, muchos procesos en el sistema nervioso central se reflejan en el LCR, haciéndola un líquido valioso de diagnóstico. CSF tiene una composición compleja, que contiene proteínas que abarcan un rango de concentración de 8-9 órdenes de magnitud. Además de proteínas, estudios anteriores han demostrado también la presencia de un gran número de péptidos endógenos. Mientras menos estudiado que las proteínas, estas también pueden tener interés potencial como biomarcadores.

Péptidos endógenos se separaron del contenido de proteína del CSF a través de filtración MWCO. Quitando la mayoría del contenido proteínico de la muestra, es posible aumentar el volumen de la muestra estudiada y así también el importe total de los péptidos endógenos. La complejidad de la mezcla filtrada péptido fue abordada mediante la inclusión de una fase inversa paso de fraccionamiento antes de HPLC (RP) a un pH alcalino antes el análisis por LC-MS. El fraccionamiento fue combinado con un esquema simple concatenación donde 60 fracciones se agruparon en 12, consumo de tiempo de análisis así podría reducirse evitando en gran parte la elución.

Identificación de péptidos automatizada fue realizada usando programas de software de identificación de tres diferentes péptidos/proteínas y posteriormente combinar los resultados. Los diferentes programas fueron complementarios más que comparable con menos del 15% de las identificaciones comprometidos entre los tres.

Introduction

Biomarcadores en líquido cefalorraquídeo (LCR) están transformando actualmente investigación en enfermedades neurodegenerativas. En la enfermedad de Alzheimer, el trastorno neurodegenerativo más común, afectando a más 60 millones de personas en todo el mundo1,2, un trío de biomarcadores de la beta amiloide péptido, estabilización de microtúbulos de proteína tau y un fosforilados forma de tau, puede detectar la enfermedad con alta sensibilidad y especificidad y ha sido incluido en los criterios de investigación diagnóstica3. En otras enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson y esclerosis múltiple, estudios proteómicos han identificado a numerosos candidatos de biomarcadores, algunas de las cuales actualmente están siendo evaluados en estudios clínicos4,5 ,6.

Junto a las proteínas, CSF también contiene una gran cantidad de péptidos endógenos7,8,9,10,11,12. Que constituyen productos de escote de muchas proteínas derivado del cerebro, estos péptidos también representan una fuente potencialmente importante de biomarcadores de la enfermedad. Para aumentar el inventario de péptidos endógenos identificados en LCR humana y permiten análisis de endopeptidomic de la CFS en estudios clínicos, se desarrolló un método para la preparación de la muestra y el análisis por LC-MS (un esquema breve protocolo ha sido incluido en la figura 1 ). La aplicación de este método en un estudio reciente resultó en la identificación de péptidos endógenos casi 16.400 del CSF en muestras de CSF combinadas de varios individuos de diagnósticos no específicos, ampliando el conocido endopeptidome de CSF diez veces13. El método puede utilizarse opcionalmente junto con enfoque etiquetado isobárica para la cuantificación.

Preparación de la muestra

La fuente principal de la masa de proteína en LCR es los componentes del plasma (albúmina e inmunoglobulinas) pasar por encima de la sangre cerebral barrera14,15. Su abundancia alta dificulta la detección de componentes de la muestra bajo abundante, derivado del cerebro. Péptidos endógenos pueden ser fácilmente separados de las proteínas alto abundante, lo que permite un mayor volumen de extracto de péptido CSF a utilizarse para el análisis de LC-MS, lo que permite la detección de péptidos inferior abundante.

En el protocolo presentado aquí, filtración de peso molecular (MWCO) de corte sirvió para separar los péptidos de la CSF de la fracción de proteína; un método que se ha utilizado en varios anteriores estudios8,9,10,11,12,16. El paso de filtración fue seguido por un paso de fraccionamiento anterior RP HPLC offline realizado sobre un gradiente de fase móvil de alto pH. Realizando dos pasos RP HPLC en tándem, con el pH siendo la principal distinción, la diferencia en selectividad entre los dos pasos resulta principalmente de la retención de péptidos alterados como consecuencia de Estados de carga distintos péptidos. La solicitud de fraccionamiento antes de péptidos de alto pH antes de LC-MS en condiciones ácidas ha demostrado ser eficaz en el aumento de péptidos identificación17,18e incluso a ser superior para este fin en complejo biológico muestras en comparación con más separación orthogonal modos19, como fuerte gato-ion exchange (SCX) y RP20. Para acortar el tiempo de análisis, se utilizó un esquema de concatenación, puesta en común cada fracción 12th (p. ej., fracciones 1, 13, 25, 37 y 49), que debido a la alta energía de RP HPLC todavía en gran medida evita la elución de péptidos de diferente fracciones en el LC-MS paso20,21.

Identificación de péptidos

Identificación del péptido en peptidomic estudios difiere de estudios proteómicos en que ninguna hendidura de la enzima se puede especificar en la búsqueda de la base de datos, y como consecuencia, las tasas de identificación son generalmente más bajo11. Un reciente estudio13 demostró que las tasas de identificación de péptidos endógenos obtenidos con Sequest y mascota mejoraron sustancialmente cuando el valor por defecto que el algoritmo del programa respectivo se modificó mediante la puntuación de adaptación algoritmo de percolador, indicando que algoritmos de puntuación óptima para péptidos endógenos se diferencian de la de péptidos trípticos13. En ese estudio, identificación basada en la secuenciación de novo de péptidos automático utilizando el software de picos (BSI) fue encontrado para ser complementario a los motores de búsqueda basada en huellas digitales dos fragmento iones, resultando en un conjunto mayor de identificados péptidos.

Protocol

El protocolo que se describe a continuación es una versión refinada de la utilizada en un estudio previo donde se identificaron una gran cantidad de péptidos endógenos en CSF humana15. Versiones del protocolo original implican alteraciones menores en el tratamiento previo químico del LCR, así como optimización de degradado que se utiliza para el fraccionamiento previo fuera de línea de alto pH RP HPLC. Consideraciones éticas <p class="jove_…

Representative Results

El método aquí descrito ha sido aplicado y evaluado en tres estudios antes de la introducción de fraccionamiento de la muestra (tabla 1). El primer estudio utilizado LC offline para detectar fracciones de CSF en una placa de destino de MALDI y dio lugar a péptidos endógenos identificados 73011. En los dos estudios siguientes, etiquetado isobárica se empleó. Principalmente en un control de caso de estudio para la identificación y caracterización de potenciales biomarcadores en el CSF endop…

Discussion

La introducción de un alto pH RP HPLC fraccionamiento previo paso a un protocolo previamente desarrollado para la recuperación de péptidos endógenos de ultrafiltración de peso molecular11 reducción de la complejidad relativa de la muestra y lo permitido para una 5 veces mayor volumen de muestra a ser estudiada. Esto, a su vez, incrementó la concentración del subconjunto de péptidos presentes en cada fracción y así mejora las posibilidades de detectar péptidos abundantes bajas.

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Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Muchas gracias a Tanveer Batth y colegas para asesoría en establecer el método de fraccionamiento anterior.

Este trabajo contó con financiamiento del Consejo de investigación sueco, la Wallström y Fundación Sjöblom, la pistola y Bertil Stohne Fundación Stiftelse, la Fundación de Bergwall de Magnus, Åhlén Fundación, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Knut y Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen y FoU-Västra Götalandsregionen.

Los principales destinatarios de la financiación de este proyecto fueron Kaj Blennow, Henrik Zetterberg y Johan Gobom.

Materials

 1 M Triethylammonium bicarbonate Fluka, Sigma-Aldrich 17902-100ML TEAB
 8 M Guanidinium hydrochloride Sigma-Aldrich G7294-100ML GdnHCl
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Pierce 20490 TCEP
Iodoacetamide SIGMA I1149-5G IAA
Hydroxylamine 50% (w/w) Sigma-Aldrich 457804-50ML
Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade Sigma-Aldrich 271004-2L AcN
Formic acid Fluka, Sigma-Aldrich  56302-1mL-F FA
Triflouroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-10AMP TFA
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich  30501-1L-1M NH4OH
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane Merck Millipore UFC903024 MWCO-filter
Sep-Pak C18, 100 mg Waters WAT023590 SPE-column
Resprep 12-port SPE Manifold  Restek 26077 Vacuum manifold
TMT10plex Isobaric Label Reagent Set Thermo Fisher Scientific 90110 TMT10plex
UltiMate 3000 RSLCnano LC System Dionex 5200.0356 Online sample separation
Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System Dionex IQLAAAGABHFAPBMBEZ Offline high-pH fractionation
Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBCX Mass spectrometer for sample analysis
Proteome Discoverer 2.0  Thermo Fisher Scientific IQLAAEGABSFAKJMAUH Proteomics search platform
Mascot v2.4 Matrix Science  -  Proteomics search engine
Sequest HT Thermo  -  Proteomics search engine
PEAKS v7.5  Bioinformatic Solutions Inc.)  -  Proteomics search engine
Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size Thermo Fisher Scientific 164535 Trap column (nano HPLC)
Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size Thermo Fisher Scientific 164942 Separation Column (nano HPLC)
Savant SpeedVac High Capacity Concentrators Thermo Fisher Scientific SC210A-230 SpeedVac/Vacuum concentrator
XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm Waters 186003566 Separation Column (micro HPLC)

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Hansson, K. T., Skillbäck, T., Pernevik, E., Holmén-Larsson, J., Brinkmalm, G., Blennow, K., Zetterberg, H., Gobom, J. Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid. J. Vis. Exp. (130), e56244, doi:10.3791/56244 (2017).

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