Summary

인간의 중추 신 경계에서 Endopeptidomic 분석을 위한 시료 준비

Published: December 04, 2017
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Summary

인간의 뇌 척추 액체 (CSF)에 내 인 성 펩 티 드의 질량 spectrometric 분석 하는 방법을 제시 합니다. 채용 함으로써 분자량 컷오프 필터링, 크로마 사전 분류, 대량 spectrometric 분석 및 펩 티 드 식별 전략의 후속 조합, 그것은 거의 10 배 비해 알려진된 CSF peptidome 확장 가능 이전 연구입니다.

Abstract

이 프로토콜 인간의 뇌 척추 액체 (CSF)에 내 인 성 펩 티 드를 식별 하기 위해 개발 하는 방법을 설명 합니다. 이 위해 이전 개발된 방법 분자량 컷오프 (MWCO) 여과에 기반 하 고 대량 spectrometric 분석 오프 라인 높은 pH 역 상 HPLC 사전 분류 단계와 결합 되었다.

CSF로 분 비 중추 세포에 의해 창 고 분자의 제거를 위한 주요 통로 이다. 따라서, 중앙 신경 시스템에 많은 프로세스 CSF, 그것에 게 귀중 한 진단 유체 렌더링에 반영 됩니다. CSF는 8-9 배나의 농도 범위에 걸쳐 있는 단백질을 포함 하는 복잡 한 구성, 있다. 단백질, 게다가 이전 연구 또한 내 인 성 펩 티 드의 많은 수의 존재를 증명 하고있다. 단백질 보다 덜 광범위 하 게 공부 하는 동안이 또한 생체로 잠재적인 관심을 고정할 수 있습니다.

내 인 성 펩 티 드 MWCO 여과 통해 CSF 단백질 함량에서 분리 되었다. 샘플에서 대부분의 단백질 콘텐츠를 제거 하 여 공부 샘플 볼륨 및 그로 인하여 또한 내 인 성 펩 티 드의 총 금액 증가 가능 하다. 침투 펩 티 드 혼합물의 복잡성 역 위상 LC MS 분석 전에 알칼리 pH에서 (RP) HPLC 사전 분류 단계를 포함 하 여 해결 했다. 분류는 결합 되었다 60 분수 12에 풀링된 했다 간단한 연결 계획, 분석 시간 소비 함으로써 감소 될 수 있었다 아직도 크게 공동 차입을 피하고 있는 동안.

자동화 된 펩 티 드 식별 3 가지 펩타이드/단백질 식별 소프트웨어 프로그램을 사용 하 고 이후 결과 결합 하 여 수행 되었다. 다른 프로그램 보완 보다는 세 사이 겹쳐 식별의 15%와 비교 했다.

Introduction

뇌 척추 액체 (CSF)에서 생체 신경 퇴행 성 질환으로 현재 연구를 변형 시키고 있다. 전세계1,2, 펩 티 드 아 밀 로이드 베타 단백질 타우 microtubule 안정화의 구성 된 바이오 마커 triplet 사람들은 Alzheimer의 질병, 60 백만 이상에 영향을 미치는 가장 일반적인 신경 장애, 그리고 phosphorylated 타우 형태, 높은 감도와 특이성, 질병을 검색할 수 있습니다 및 진단 연구 조건3에 포함 되었습니다. 다른 신경 퇴행 성 질환, 파 킨 슨 병, 다 발성 경화 증 등에서 proteomic 연구의 일부는 현재 임상 연구4,5 에서에서 평가 받고 있다 수많은 바이오 마커 후보 식별 6.

CSF에는 단백질, 함께 내 인 성 펩 티 드7,8,9,10,,1112의 풍부한을 또한 포함 되어 있습니다. 많은 두뇌 파생 된 단백질의 분열 제품 구성, 이러한 펩 티이 드 또한 질병 biomarkers의 잠재적으로 중요 한 소스를 나타냅니다. 인간 CSF에서 확인 된 내 인 성 펩 티 드의 재고 증가 및 CSF endopeptidomic 분석 임상 연구에 사용, 방법 개발 샘플 준비 및 LC MS 분석 (간단한 프로토콜 스키마에에서 포함 된 그림 1 ). 최근 연구에서이 방법의 응용 확대 알려진된 CSF endopeptidome ten-fold13일반적인 진단의 몇몇 개인에서 풀링된 CSF 샘플에 거의 16,400 생 CSF 펩 티 드의 식별에 결과. 메서드를 선택적으로 정량화를 위한 isobaric 라벨 방식으로 함께에서 사용할 수 있습니다.

샘플 준비

CSF 단백질 질량의 주요 소스는 플라즈마 성분 (알 부 민 및 면역 글로불린) 혈액 두뇌 방 벽14,15위에 통과. 그들의 높은 풍부 낮은 풍부 하 고, 두뇌 파생 샘플 구성 요소 검색에 지장을 초래할 수 있습니다. 내 인 성 펩 티 드를 쉽게 따라서 낮은 풍부한 펩 티 드의 탐지 하도록 LC MS 분석에 사용할 CSF 펩타이드 추출의 훨씬 더 큰 볼륨을 수 있도록 높은 풍부한 단백질에서 분리 수 있습니다.

여기에 제시 된 프로토콜에서 분자량 (MWCO) 잘라 여과 단백질 분수;에서 CSF 펩 티 드를 분리 사용 되었다 몇몇 이전에 사용 된 방법8,,910,11,,1216공부 한다. 여과 단계는 높은 pH 모바일 위상 그라데이션을 통해 오프 라인 RP HPLC 사전 분류 단계에 선행 되었다. 주요 구별 되 고 ph에 두 RP HPLC 단계를 수행 하 여 두 단계 사이의 선택의 차이 다른 펩 티 드 충전 상태 결과로 변경 된 펩 티 드 보존에서 주로 발생 합니다. 산 성 조건 하에서 LC-MS 전에 높은 pH 펩 티 드 사전 분류의 응용 프로그램 펩 티 드 식별17,18, 증가에 되도록 우수한이 목적을 위해 복잡 한 생물 학적 효과 입증 샘플 더 직각 분리 모드19, 강한 고양이-이온 교환 (SCX)와 RP20에 비해. 분석 시간 단축, 연결 체계를 사용 되었다, 모든 12번째 분수 (예를 들어, 분수 1, 13, 25, 37, 및 49), RP HPLC의 높은 분해능으로 인해 여전히 크게 다른 펩 티 드의 공동 차입을 피할 수 있는 풀링 LC-MS에서 분수20,21단계.

펩 티 드 식별

Peptidomic 연구에서 펩 티 드 식별이 다릅니다 proteomic 연구의 아무 효소 분열 데이터베이스 검색에 지정할 수 있으며 식별 요금은 일반적으로 낮은11는 결과적으로. 최근 연구13 했다 내 인 성 펩 티 드로 얻은 Sequest 및 마스코트에 대 한 식별 요금 각각 소프트웨어 프로그램의 알고리즘을 득점 하는 기본 적응 점수를 사용 하 여 수정 된 때에 상당히 개선 했다 여과기, 내 인 성 펩 티 드에 대 한 최적의 점수 알고리즘 tryptic 펩 티 드13의 다 나타내는 알고리즘입니다. 연구, 식별 소프트웨어 봉우리 (BSI)를 사용 하 여 자동 펩타이드 de novo 연속에 따라 두 조각 이온 지문 기반 검색 엔진에 무료 발견 했다, 그의 훨씬 더 큰 집합에서 결과 확인 펩 티 드입니다.

Protocol

아래에 설명 된 프로토콜은 많은 양의 내 인 성 펩 티 드 인간 CSF15에 발견 했다 이전 연구에서 사용 되는 것의 세련 된 버전입니다. 원래 프로토콜에 대 한 업데이트 CSF의 화학 사전 처리에 사소한 변경 뿐만 아니라 오프 라인 높은 pH RP HPLC 사전 분류에 사용 되는 그라데이션의의 최적화를 포함 한다. 윤리적인 고려 사항 스웨…

Representative Results

여기 설명 하는 방법은 적용 되어 있으며 샘플 사전 분류 (표 1)을 도입 하기 전에 세 가지 연구에서 평가. 첫 번째 연구는 MALDI 표적 격판덮개에 CSF 분수를 안보에 대 한 오프 라인 LC를 사용 하 고 730 확인 된 내 인 성 펩 티 드11결과. 두 다음 연구에서 isobaric 라벨 고용 되었다. 케이스/제어에 주로 식별 및 CSF endopeptidome에 프로테옴 잠재적인 생체의 특성에 대 한 동시에 연구<sup class…

Discussion

높은 pH RP HPLC 사전 분류 하는 단계 내 인 성 펩 티 드의 복구에 대 한 이전 개발된 프로토콜 분자량 외11 의 상대 샘플 복잡성을 감소 및 그로 인하여 5-fold 더 큰 허용 공부를 해야 샘플 볼륨. 이, 차례로, 각 분수에 펩 티 드의 부분 집합의 농도 증가 하 고 그로 인하여 낮은 풍부한 펩 티 드는 검출의 기회를 향상.

동시에 3 개의 proteomic 소프트웨어 고용 내 인 성…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

많은 Tanveer Batth와 동료 조언 사전 분류 방법 설정에 대 한 감사 합니다.

이 작품에서 스웨덴 연구 위원회는 Wallström 및 Sjöblom 재단, 총 및 베 Stohne 기초 Stiftelse, 매 그 너 스 Bergwall 재단, Åhlén 재단, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen 염 자금에 의해 지원 되었다 Gamla Tjänarinnor는 크누트와 앨리스 발 렌 버그 재단, Frimurarestiftelsen을 FoU 서쪽 Götalandsregionen.

이 프로젝트에 대 한 자금 지원의 주요 받는 Kaj Blennow, 헨릭 Zetterberg와 요한 Gobom 했다.

Materials

 1 M Triethylammonium bicarbonate Fluka, Sigma-Aldrich 17902-100ML TEAB
 8 M Guanidinium hydrochloride Sigma-Aldrich G7294-100ML GdnHCl
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Pierce 20490 TCEP
Iodoacetamide SIGMA I1149-5G IAA
Hydroxylamine 50% (w/w) Sigma-Aldrich 457804-50ML
Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade Sigma-Aldrich 271004-2L AcN
Formic acid Fluka, Sigma-Aldrich  56302-1mL-F FA
Triflouroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-10AMP TFA
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich  30501-1L-1M NH4OH
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane Merck Millipore UFC903024 MWCO-filter
Sep-Pak C18, 100 mg Waters WAT023590 SPE-column
Resprep 12-port SPE Manifold  Restek 26077 Vacuum manifold
TMT10plex Isobaric Label Reagent Set Thermo Fisher Scientific 90110 TMT10plex
UltiMate 3000 RSLCnano LC System Dionex 5200.0356 Online sample separation
Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System Dionex IQLAAAGABHFAPBMBEZ Offline high-pH fractionation
Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBCX Mass spectrometer for sample analysis
Proteome Discoverer 2.0  Thermo Fisher Scientific IQLAAEGABSFAKJMAUH Proteomics search platform
Mascot v2.4 Matrix Science  -  Proteomics search engine
Sequest HT Thermo  -  Proteomics search engine
PEAKS v7.5  Bioinformatic Solutions Inc.)  -  Proteomics search engine
Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size Thermo Fisher Scientific 164535 Trap column (nano HPLC)
Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size Thermo Fisher Scientific 164942 Separation Column (nano HPLC)
Savant SpeedVac High Capacity Concentrators Thermo Fisher Scientific SC210A-230 SpeedVac/Vacuum concentrator
XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm Waters 186003566 Separation Column (micro HPLC)

Riferimenti

  1. Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
  2. Scheltens, P., et al. Alzheimer’s disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
  3. Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer’s disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
  4. Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer’s disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
  5. Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
  6. Höglund, K., et al. Alzheimer’s disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
  7. Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
  8. Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
  9. Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
  10. Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
  11. Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
  12. Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
  13. Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
  14. Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
  15. Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
  16. Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
  17. Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
  18. Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
  19. Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
  20. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  21. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  22. Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
  23. Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
  24. Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).

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Citazione di questo articolo
Hansson, K. T., Skillbäck, T., Pernevik, E., Holmén-Larsson, J., Brinkmalm, G., Blennow, K., Zetterberg, H., Gobom, J. Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid. J. Vis. Exp. (130), e56244, doi:10.3791/56244 (2017).

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