Summary

In Vivo Multimodale beeldvorming en analyse van Laser-geïnduceerde Choroidal Neovascularization muismodel

Published: January 21, 2018
doi:

Summary

Hier presenteren we het nut van longitudinale in vivo imaging in de follow-up van de morfologische veranderingen van laser-geïnduceerde choroidal neovascularization in muizen.

Abstract

Laser-geïnduceerde choroidal neovascularization (CNV) is een reeds lang gevestigde model na te bootsen de natte vorm van leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (AMD). In dit protocol willen we de lezer niet alleen door de technische overwegingen voor het genereren van laser-geïnduceerde laesies om te activeren neovascular processen, maar eerder de nadruk op de krachtige informatie die kan worden verkregen vanuit de multimodale longitudinale gids in vivo imaging in de follow-up periode.

De laser-geïnduceerde muis CNV model werd gegenereerd door een diode laser rechtsbedeling. Multimodale in vivo imaging technieken werden gebruikt voor het controleren van CNV inductie, progressie en regressie. Eerste, spectrale domein optische coherentie tomografie (SD-OCT) werd uitgevoerd onmiddellijk na het laseren om te controleren of een onderbreking van de Bruch membraan. Latere in vivo imaging met fluoresceïne-angiografie (FA) bevestigd succesvolle schade van Bruch de membraan van seriële beelden verworven op choroidal niveau. Longitudinale follow-up van CNV proliferatie en regressie op dagen 5, 10 en 14 na het laseren werd uitgevoerd met behulp van zowel de SD-OCT en de FA. Eenvoudige en betrouwbare sortering van lekkende CNV leasions van FA beelden wordt gepresenteerd. Automatische segmentatie voor meting van de totale dikte van het netvlies, gecombineerd met handmatige kaliber toepassing voor meting dikte van de retinale bij CNV sites, toestaan onbevooroordeelde evaluatie van de aanwezigheid van oedeem. Ten slotte is de histologische verificatie van CNV uitgevoerd met behulp van isolectin GS-IB4 kleuring op choroidal flatmounts. De kleuring is thresholded, en het gebied isolectin-positief wordt berekend met ImageJ.

Dit protocol is vooral handig in therapeutics studies vereisen hoge-doorvoer-achtige screening van CNV pathologie aangezien het toestaat snel, multimodale en betrouwbare classificatie van CNV pathologie en retinale oedeem. Bovendien, kan hoge resolutie SD-OCT de opname van andere pathologische kenmerken, zoals de vochtophoping subretinal of intraretinal. Deze methode biedt echter geen mogelijkheid voor het automatiseren van CNV volume analyse van SD-OCT beelden, die moet handmatig worden uitgevoerd.

Introduction

De eerste succesvolle poging om na te bootsen de pathologie van menselijke CNV bij knaagdieren werd bijna drie decennia geleden aangetoond met een laser krypton in Long-Evans ratten1. Daarna werd een krypton laser gebruikt om breken Bruch de membraan in de meest populaire muis spanning, C57BL/6J2,3,4. Het slagingspercentage van CNV inductie werd gecontroleerd met FA en histologische vlekken. Een snelle ontwikkeling van noninvasive beeldvormende modaliteiten, zoals okt, bevorderd de groei van het gebied van knaagdier preklinische modellen. De mogelijkheid om te controleren van morfologische veranderingen in het netvlies op meerdere tijdstippen in de dezelfde ogen aanzienlijk bijdraagt aan de vermindering van dierlijke gebruik en verhoogt de efficiëntie in experimentele studies. Histologische evaluatie van CNV laesies is eerder ongecompliceerd, en vereist labeling van abnormale vasculaire groei rond de site van laser administratie en beeldacquisitie gebied/volume schatting met behulp van de software van de analyse van een afbeelding. In vivo imaging modaliteiten introduceren daarentegen meer complexe analyses van CNV pathologie en de interpretatie ervan.

Hier presenteren we een eenvoudige en relatief snelle methode om de rang inductie, progressie en regressie van CNV met behulp van FA, SD-OCT, en de automatische segmentatie methode in de muis laser-geïnduceerde CNV model.

Protocol

Alle dieren waren behandeld in overeenstemming met de verklaring van ARVO voor het gebruik van dieren in Ophthalmic en onderzoek van de visie en de EG-richtlijn 86/609/EEG voor dierproeven, met behulp van protocollen goedgekeurd en gecontroleerd door het dier Experiment Board van Finland. 1. laser-geïnduceerde muis CNV model 5 Inspecteer de ogen van het dier macroscopisch voor eventuele afwijkingen. Weeg de muis. Berekenen en bereiden een …

Representative Results

Een zeepbel of subretinal bloeden onmiddellijk na het laseren is niet altijd zichtbaar. SD-OCT is daarom bijzonder belangrijk om te controleren of de schade van de Bruch membraan. Figuur 1 toont een voorbeeld van OCT imaging op verschillende tijdstippen na toediening van de laser. Figuur 1</stron…

Discussion

Multimodale imaging biedt waardevolle hulpmiddelen voor CNV pathologie evaluatie. Hier presenteerden we een imaging protocol bestaande uit FA, SD-OCT, en automatische segmentatie voor de snelle, reproduceerbare en betrouwbare evaluatie van CNV pathologie. Een onderbreking van de Bruch membraan na laser regering werd bevestigd. Bovendien mag het gebruik van SD-OCT in dit stadium ook directe visualisatie van mogelijke intraretinal en subretinal bloeduitstortingen, die de interpretatie van resultaten verwarren kunnen. Netvl…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedank Yuliya Naumchuk (Loyola Universiteit Chicago) en Agne Žiniauskaitė (Experimentica Ltd.) voor uitstekende technische en videografische steun. Dr. Kaja het onderzoeksprogramma wordt ondersteund door de Dr. John P. en Therese E. Mulcahy begiftigd hoogleraarschap in oogheelkunde aan de Loyola Universiteit van Chicago.

Materials

Medetomidine (commercial name Domitor) Orion Vnr 01 56 02 Anesthesia
Ketamine Intervet Vnr 51 14 85 Anesthesia
0,9% NaCl B Braun 357 0340 Anesthesia
Xylazine (commercial name Rompun vet) Bayer vnr 14 89 99 Anesthesia
Tropicamide Santen Vnr 04 12 36 Mydriatic agent
Viscotears Alcon Vnr 44 54 81 Lubricant
Systane Alcon  - Lubricant
5% Fluorescein sodium salt Sigma Aldrich F6377-100G Fluoresent agent
Atipamezole (commercial name Antisedane) Orion Vnr 47 19 53 Anesthesia

Riferimenti

  1. Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat. Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).
  2. Tobe, T., et al. Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).
  3. Seo, M. S., et al. Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor. Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).
  4. Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).
  5. Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. J Vis Exp. (106), e53502 (2015).
  6. Giani, A., et al. In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).
  7. Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PloS One. 10, e0132643 (2015).
  8. Sheets, K. G., et al. Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse. Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).
  9. Hoerster, R., et al. In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
  10. Sulaiman, R. S., et al. A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization. J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).

Play Video

Citazione di questo articolo
Ragauskas, S., Kielczewski, E., Vance, J., Kaja, S., Kalesnykas, G. In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model. J. Vis. Exp. (131), e56173, doi:10.3791/56173 (2018).

View Video