Modulazione reversibile mediata dalla luce del percorso proteico di kinasi attivato da Mitogen durante la differenziazione cellulare e<em> Xenopus</em> Sviluppo embrionale

I fattori di crescita sono coinvolti in un ampio spettro di funzioni cellulari, tra cui la proliferazione, la differenziazione, la migrazione e l'apoptosi e svolgono ruoli chiave in molti eventi biologici, inclusi lo sviluppo embrionale, l'invecchiamento e la regolazione dello stato mentale ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . Molti fattori di crescita segnano attraverso complesse cascate intracellulari di segnalazione. Questi eventi di segnalazione sono spesso gestiti da fosforilazione proteica reversibile in modo preciso regolato ^{6 , 7} . Pertanto, una comprensione dei risultati di segnalazione delle proteine ​​chinasi, che sono responsabili della fosforilazione proteica, è fondamentalmente importante.

Diversi fattori di crescita agiscono attraverso una rete di segnalazione intracellulare piuttosto comune, anche se stimolano distRisposte cellulari inct ^{8 , 9} . I mediatori intracellulari comuni delle chinasi di tirosinici del recettore includono Ras, Raf, chinasi extracellulare-regolata (ERK), proteina chinasi attivata da mitogeni (MAPK) / ERK chinasi (MEK), fosfoinositide 3-chinasi (PI3K), Akt e gamma fosfolipasi C (PLCγ) ^{10 , 11} . L'accumulo di prove suggerisce che la diversità di segnalazione e la specificità dipendono dalla regolazione spaziale e temporale dell'attività di segnalazione ¹² . Ad esempio, nelle cellule di phaocromocytoma di ratto (PC12), la stimolazione del fattore di crescita epidermico (EGF), che provoca la proliferazione cellulare, attiva temporaneamente il percorso ERK ⁹ . D'altra parte, la stimolazione con il fattore di crescita del nervo (NGF), che porta alla differenziazione cellulare, attiva il percorso ERK in modo sostenibile ^{9 , 13} . In colture rNei neuroni ippocampali, la segnalazione transitoria da un fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) favorisce la crescita primaria del neurite, mentre la segnalazione sostenuta porta ad una maggiore ramificazione del neurite ¹⁴ . Durante il primo sviluppo embrionale, l'attività ERK fosforilata è temporaneamente dinamica e diffusa nell'embrione ⁶ . Una recente schermata genetica durante l'embriogenesi iniziale di Xenopus ha mostrato che le cascate di segnalazione ERK e Akt, due percorsi di fattore di crescita primario a valle, mostrano i profili di attivazione specifici di fase ⁷ . Così, una comprensione dei risultati di segnalazione di chinasi richiede strumenti che possono sondare le caratteristiche spaziali e temporali dell'attività cinasi con una risoluzione sufficiente.

Approcci sperimentali convenzionali per sondare la natura dinamica della trasduzione del segnale durante lo sviluppo non hanno la desiderabile risoluzione spaziale e temporale. Ad esempio, gli approcci farmacologici utilizzano la piccola chemMolecole ical o biologiche per stimolare o sopprimere la trasduzione del segnale nelle cellule e nei tessuti. La natura diffusa di queste piccole molecole rende difficile limitare la loro azione ad una regione specifica di interesse. Gli approcci genetici ( ad esempio, transgenesi, il sistema Cre-Lox o mutagenesi) spesso portano all'attivazione o alla repressione irreversibili dell'espressione genica o dell'attività proteica ^{16 , 17 , 18} . Il sistema Tet-On / Tet-Off ¹⁹ offre un controllo temporale migliorato della trascrizione del gene, ma manca di un controllo spaziale rigoroso perché si basa sulla diffusione della tetraciclina. I recenti sviluppi nella dimerizzazione delle proteine ​​chimicamente indotti dalla chimica ²⁰ o nella foto-scoperta ^{21 , 22 , 23 , 24} hanno notevolmente miglioramentiEd il controllo temporale delle reti di segnalazione. Il controllo spaziale, tuttavia, rimane impegnativo a causa della diffusione dei prodotti chimici in gabbia.

Recenti approcci optogenetici emergenti, che sfruttano il potere di luce per controllare le interazioni proteine-proteine, consentono la modulazione di percorsi di segnalazione con elevata precisione spatiotemporale e reversibilità. Poco dopo il suo successo iniziale nel controllo del cervello neuronale ^{25 , 26 , 27} , l'ottogenetica è stata estesa per controllare altri processi cellulari, come la trascrizione di geni, la traduzione, la migrazione cellulare, la differenziazione e l'apoptosi ^{28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34} . Una strategia che utilizza il pProteina hotoattivatabile La proteina cripto- cromica 2 (CRY2) di Arabidopsis thaliana e il dominio N-terminale dell'elica a base di elicoidale (CIBN) che interagiscono con citochrome è stato recentemente sviluppato per controllare l'attività di Raf1-chinasi nelle cellule di mammiferi e negli embrioni Xenopus ³⁵ . CRY2 si lega a CIBN su stimolazione azzurra-luce e il complesso proteico CRY2 / CIBN dissociata spontaneamente nel buio ³⁴ . La luce blu eccita il cofattore CRY2, il dinucleotide di flavin adenina (FAD), che porta ad un cambiamento conformazionale in CRY2 e successivamente legato a CIBN. I mutanti costituenti attivamente attivi (W374A) e flavin-deficienti (D387A) di CRY2 possono essere prodotti attraverso mutazioni nella tasca di legame FAD: il mutante CRY2 ^W374A si lega a CIBN indipendente dalla luce, mentre il mutante CRY2 ^D387A non si lega a CIBN sotto l'azzurro Stimolazione luminosa ^{36 , 37} . Il sistema ottogenetico descritto iN questo protocollo utilizza il tipo di wild-type CRY2 e CIBN per indurre l'attivazione Raf1 mediata dalla traslocazione proteica in cellule vive. È noto che il reclutamento della membrana di Raf1 aumenta la sua attività ³⁸ . In questo sistema, un modulo CIBN tandem è ancorato alla membrana plasmatica e CRY2-mCherry è fuso al terminale N di Raf1 ³⁵ . In assenza di luce blu, CRY2-mCherry-Raf1 rimane nel citoplasma, e Raf1 è inattivo. La stimolazione della luce blu induce il legame CRY2-CIBN e recluta Raf1 alla membrana plasmatica, in cui viene attivata Raf1. L'attivazione Raf stimola una cascata di segnalazione Raf / MEK / ERK. Entrambe le proteine ​​di fusione CRY2 e CIBN sono codificate in un sistema genetico bicistronico. Questa strategia può essere generalizzata per controllare altre chinasi, come Akt, il cui stato di attivazione può essere attivato anche dalla traslocazione proteica nelle cellule ³⁹ . Questo lavoro presenta protocolli dettagliati per l'implementazione di questa strategia optogenetica in cultu cellule di mammiferiRes e organismi multicellulari.