Modulation réversible médiée par la lumière du pathogène protéinique Kinase activé par Mitogen pendant la différenciation cellulaire et<em> Xenopus</em> Développement embryonnaire

Les facteurs de croissance sont impliqués dans un large éventail de fonctions cellulaires, y compris la prolifération, la différenciation, la migration et l'apoptose, et jouent un rôle central dans de nombreux événements biologiques, y compris le développement embryonnaire, le vieillissement et la régulation de l'état mental ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . De nombreux facteurs de croissance signalent des cascades de signalisation intracellulaire complexes. Ces événements de signalisation sont souvent opérés par la phosphorylation réversible des protéines de manière réglementée ^{6 , 7} . Ainsi, une compréhension des résultats de signalisation des protéines kinases, qui sont responsables de la phosphorylation des protéines, est fondamentalement importante.

Différents facteurs de croissance agissent à travers un réseau de signalisation intracellulaire assez fréquent, bien qu'ils stimulent distRéactions cellulaires internes ^{8 , 9} . Les médiateurs intracellulaires communs des tyrosine kinases réceptrices comprennent Ras, Raf, la kinase extracellulaire régulée par le signal (ERK), la protéine kinase activée par un mitogène (MAPK) / ERK kinase (MEK), la phosphoinositide 3-kinase (PI3K), l'Akt et la phospholipase C gamma (PLCγ) ^{10 , 11} . Les données recueillies suggèrent que la diversité et la spécificité de la signalisation dépendent de la régulation spatiale et temporelle de l'activité de signalisation ¹² . Par exemple, dans les cellules de phéochromocytome de rat (PC12), la stimulation du facteur de croissance épidermique (EGF), qui entraîne une prolifération cellulaire, active de manière transitoire la voie ERK ⁹ . D'autre part, la stimulation avec le facteur de croissance nerveuse (NGF), qui conduit à la différenciation cellulaire, active la voie ERK de manière soutenue ^{9 , 13} . En cultureChez les neurones de l'hippocampe, la signalisation transitoire par le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) favorise l'essor primaire des neurites, tandis que la signalisation prolongée conduit à une augmentation de la dérivation des neurites ¹⁴ . Au début du développement embryonnaire, l'activité ERK phosphorylée est temporairement dynamique et est répandue dans l'embryon ⁶ . Un écran génétique récent lors de l'embryogenèse précoce de Xenopus a montré que les cascades de signalisation ERK et Akt, deux voies du facteur de croissance primaire en aval, affichent des profils d'activation spécifiques à l'étape ⁷ . Ainsi, une compréhension des résultats de la signalisation kinase nécessite des outils qui peuvent sonder les caractéristiques spatiales et temporelles de l'activité kinase avec une résolution suffisante.

Les approches expérimentales conventionnelles pour sonder la nature dynamique de la transduction du signal pendant le développement n'ont pas la résolution spatiale et temporelle souhaitable. Par exemple, les approches pharmacologiques utilisent une petite chemMolécules biologiques ou biologiques pour stimuler ou supprimer la transduction du signal dans les cellules et les tissus. La nature diffusive de ces petites molécules rend difficile de restreindre leur action à une région d'intérêt spécifique ¹⁵ . Les approches génétiques ( par exemple, la transgénèse, le système Cre-Lox ou la mutagenèse) conduisent souvent à une activation ou à une répression irréversible de l'expression du gène cible ou de l'activité protéique ^{16 , 17 , 18} . Le système Tet-On / Tet-Off ¹⁹ offre un contrôle temporel amélioré de la transcription des gènes mais manque de contrôle spatial strict car il repose sur la diffusion de la tetracycline. Les développements récents de la dimérisation des protéines chimiquement induites ²⁰ ou des photos ^{21 , 22 , 23 , 24} ont considérablement amélioréLe contrôle temporel des réseaux de signalisation. Le contrôle spatial, cependant, reste difficile en raison de la nature diffusive des produits chimiques en cage.

Les approches optogénétiques émergentes récentes, qui exploitent la puissance de la lumière pour contrôler les interactions protéine-protéine, permettent la modulation des voies de signalisation avec une haute précision spatio-temporelle ainsi qu'une réversibilité. Peu après son succès initial dans le contrôle des tirs neuronaux ^{25 , 26 , 27} , l'optogenèse a été étendue pour contrôler d'autres processus cellulaires, tels que la transcription des gènes, la traduction, la migration cellulaire, la différenciation et l'apoptose ^{28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34} . Une stratégie utilisant la pLa combinaison de protéines hotoactivables La protéine de cryptochrome 2 d' Arabidopsis thaliana (CRY2) et le domaine N-terminal de l'hélice-boucle de base-hélice basique (CIBN) qui coopère avec le cryptochrome ont récemment été développés pour contrôler l'activité de Raf1 kinase dans des cellules de mammifères et des embryons de Xenopus ³⁵ . CRY2 se lie à CIBN lors de la stimulation de la lumière bleue, et le complexe de protéines CRY2 / CIBN se dissocie spontanément dans l'obscurité ³⁴ . La lumière bleue excite le cofacteur CRY2, le dinucléotide d'adénine de flavine (FAD), ce qui conduit à une modification conformationnelle de CRY2 et à sa liaison ultérieure à CIBN. Des mutants actifs actifs (W374A) et des déficients en flavine (D387A) de CRY2 peuvent être produits par des mutations dans la poche de liaison au FAD: le mutant CRY2 ^W374A se lie à CIBN indépendamment de la lumière, alors que le mutant CRY2 ^D387A ne se lie pas à la CIBN sous le bleu – stimulation lumineuse ^{36 , 37} . Le système opto-génétique décrit iN ce protocole utilise CRY2 et CIBN de type sauvage pour induire une activation de Raf1 médiée par translocation de protéines dans des cellules vivantes. On sait que le recrutement membranaire de Raf1 améliore son activité ³⁸ . Dans ce système, un module tandem CIBN est ancré à la membrane plasma et CRY2-mCherry est fusionné à la N-terminal de Raf1 ³⁵ . En l'absence de lumière bleue, CRY2-mCherry-Raf1 reste dans le cytoplasme et Raf1 est inactif. La stimulation à la lumière bleue induit la liaison CRY2-CIBN et recrute Raf1 à la membrane plasmatique, où Raf1 est activé. L'activation de Raf stimule une cascade de signalisation Raf / MEK / ERK. Les protéines de fusion CRY2 et CIBN sont codées dans un système génétique bicistronique. Cette stratégie peut être généralisée pour contrôler d'autres kinases, telles que Akt, dont l'état d'activation peut également être activé par la translocation des protéines dans les cellules ³⁹ . Ce travail présente des protocoles détaillés pour la mise en œuvre de cette stratégie optogénétique dans la culture de cellules de mammifèresRes et des organismes multicellulaires.