כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מעקב גנומית דנ א (gDNA) זיהום בדגימות ה-RNA. השיטה הציג מנצל תחל ספציפיות עבור אזור פנימי מרווח משועתקים (ITS) של גנים ribosomal DNA (rDNA). השיטה מתאים זיהוי אמין, רגיש לזיהום DNA ברוב פרוקריוטים, אאוקריוטים.
שיטה אחת נעשה שימוש נרחב על כימות של שינויים בביטוי הגנים, תעתיק abundances היא הפוכה-תמלול כמותיים PCR בזמן אמת (RT-qPCR). הוא מספק תוצאות מדויקות, רגיש, אמינים ובעלי לשחזור. מספר גורמים יכולים להשפיע על רגישות וסגוליות של RT-qPCR. שיורית DNA גנומי (gDNA) זיהום דגימות ה-RNA הוא אחד מהם. ניתוח ביטוי גנטי, שאינם ספציפיים הגברה עקב זיהום gDNA מגזים השפע של התעתיק רמות, יכולים להשפיע על התוצאות RT-qPCR. באופן כללי, gDNA הוא זוהה על ידי לרביעיית-PCR באמצעות פריימר זוגות חישול אזורים intergenic או אינטרון של הגן עניין. למרבה הצער, ביאורים אינטרון/אקסון אינן ידועות עד היום עבור כל הגנים בעלי חוליות, חיידקים, פרוטיסטים, פטריות, צמחים, הגעה מינים metazoan.
כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור זיהוי של gDNA זיהום ב- RNA דגימות באמצעות ribosomal DNA (rDNA)-המבוסס על צבעי יסוד. השיטה מבוססת על האלמנטים הייחודיים של rDNA: multigene הגדול יצורים עילאיים, רצפים מאוד שנשמרת, ואופיים בתדירות גבוהה הגנום. גם כמקרה, ערכה ייחודית של תחל תוכננו בהתבסס על אזור שנשמרת ribosomal DNA (rDNA) בממשפחת הדגניים. האוניברסליות של הזוגות פריימר נבחנה ע י להמיס עקומת ניתוח ו- agarose בג’ל. למרות השיטה שלנו מסביר איך תחל מבוססי rDNA יכול להיות מיושם עבור וזמינותו זיהום gDNA ב ממשפחת הדגניים, זה יכול היה בקלות לשמש מינים אחרים פרוקריוטים איקריוטים
חקר תעתיק ויסות מעניין ערכות הגן או רשתות איתות חיוני להבין את המנגנונים המולקולריים מורכבים מעורב אירועים ביולוגי1. כיום, ניתוח qPCR הוא הנפוצים ביותר בגישה ללימודי ג’ין ביטוי שיכולות היעד או דנ א (הגנום) או RNA (transcriptome) אשר מאפשרות methylome וניתוח transcriptome, בהתאמה. שעתוק במהופך (RT) ואחריו qPCR נעשה שימוש נרחב לניתוח transcriptome למדוד רמות ביטוי גנים במגוון תחומי המחקר הביולוגי2. לעומת אחרים שיטות כמו הכלאה הצפונית המסורתית, רקמות זיהוי ספציפי באמצעות באתרו בתוך הכלאה ribonuclease מבחני הגנה (RPA), דו-RT-PCR, הדיוק, נוחות, מהירות ואת טווח דינמי רחב מבחני מבוססי qPCR הם מאוד יוצא דופן3,4. ישנם מספר גורמים חשובים שיש מועמדים כימות אמין של RNA שליח (mRNA), כולל את האיכות והכמות של RNA החל חומר. יתר על כן, הגברה שאינם ספציפיים, היעילות של RT-qPCR ויעילות PCR צריך להיחשב5,6.
הנוכחות של gDNA היא בעיה פנימית במהלך החילוץ-RNA נובע, בין השאר, דומה הפיסיקליות והכימיות של DNA ו- RNA7. בגלל זהותו רצף של gDNA ו- DNA משלימים (cDNA) נגזר מן הדגימות mRNA, הגברה שאינם ספציפיים יכול להתרחש, אשר ישפיעו על הדיוק של התוצאות RT-qPCR. GDNA הנותרים יוביל מופרזת של השפע של היעד mRNA בג’ין-ביטוי-ניתוח-8.
בעיקרון, אמפליקון שאינם ספציפיים בעיקר נובע היווצרות פריימר דיימר או רקע לא ספציפי הגברה בשל gDNA, אשר שניהם יכול להיות מוערך על ידי באמצעות דגימות הפקד המתאים. דוגמאות כאלה הן שליטה תבנית (NTC) ושליטה אין-רוורס טרנסקריפטאז (NRT), בהתאמה. מאז הרמות של זיהום gDNA הדגימות הנלמדים הם שונים, הרגישות כלפי gDNA שונה מאוד בין הגנים ניתח הפקדים NRT נדרשים עבור כל זוג מדגם/assay. למרות זה מגדיל באופן משמעותי את עלות ועבודה במחקרים פרופיל RT-qPCR, פקדים אלה הם נדרשים7,9.
שיטות אלטרנטיביות להתמודד עם זיהום gDNA כוללים את השימוש זוגות פריימר חישול אזורים intergenic או אינטרון של הגן של ריבית10, ואת השימוש תחל לאגף אינטרון גדולים או span של צומת אקסון-אקסון, קרי האתרים מחזק נעדרים ב- mRNA בוגר רצף1,4. עם זאת, הביאורים אינטרון/אקסון של כל הגנים רבים בעלי חוליות, חיידקים, פרוטיסטים, פטריות, צמחים, הגעה מינים metazoan ידועים עדיין. בנוסף, היצורים האיקריוטים רבים יש pseudogenes נגזר שכפול אירועים. עוד יותר, עיצוב פריימר על פני אינטרונים אינה מבטיחה אי-הגברה של gDNA. כמו כרומטין הנגישות של אזורים גנומית כדי DNase אני משתנה, מומלץ לתכנן פריימר שונים זוגות כרומוזומים שונים10מיקוד.
הגנום של היצורים האיקריוטים יכול להקיף עד אלף עותקים של גנים rDNA קידוד הדרושות הריבוזומים היווצרות ribosomal subunits. גנים אלה rDNA מאורגנים לעיתים קרובות מערכים יחיד או tandem חוזר11. Polycistronic rRNAs (איור 1) כולל יחידת משנה גדולה (LSU), יחידת משנה קטנים (SSU) משוקלטים על ידי RNA פולימראז אני (RNA pol אני). טרום-rRNAs וכתוצאה מכך מעובדים עוד יותר על ידי ביטול פנימי מרווח משועתקים שני האיזורים ITS1 ו- ITS2. כמו המוצרים הסופיים, שלושה מבוגרים rRNAs, 17-18S rRNA (SSU), 5.8S, 25-28S rRNA (LSU) הם שנוצר12. rDNA גנים הם טיפוסי נציגים של משפחת multigene הגדול יצורים עילאיים עם רצפי שנשמרת מאוד. הן מתרחשות עם תדירות גבוהה הגנום והן שעשויות להיות נוכח המיקום כרומוזומלית יותר מפעם אחת13. העיבוד של rRNA ההשפלה של קפיציות משועתקים הוא תהליך מהיר גרעינון. בשל רמה גבוהה של repetitiveness, היחס של עותק גנומית ומספר לזיהוי premolecules RNA לא מעובד הוא נמוך בהשוואה לאינטרון נמוך-העתק רצפים של סימנים מקדימים unspliced. תכונות אלה להפוך rDNA גנים גם מתאים לגילוי רגישות גבוהה ואמינות של זיהום gDNA פרוקריוטים, אאוקריוטים רוב3.
כאן מתואר הליך הרומן לגילוי זיהום gDNA בדגימות ה-RNA. ערכה של צבעי בסיס אוניברסלי המבוסס על הרצף rDNA והתפאורה מוצג עבור מבחני gDNA במין דגניים מספר. ירידה לפרטים, אוניברסאליות תחל המוצע נבדקו על ידי ניתוח עקומת להמיס באמצעות DNA כתבנית. פרוטוקול שלנו אינה ישימה עבור דגניים, אך יכול להתאים בקלות גם מינים אחרים האיקריוטים ו prokaryotic.
ניתוח ביטוי גנטי על ידי ה-PCR כמותי הוחל נרחב בשנים האחרונות. היתרון העיקרי של שיטה זו מהירה, חסכונית, אוטומטית הוא שלה תוצאה מדויקת. עם זאת, צובר יתרונות מיטבית מן היתרונות הללו דורש הבנה ברורה של ההתקנה של הפרמטרים המשמשים את הניסוי qPCR. כדי לקבל תוצאה אמינה בניתוח ביטוי גנים qPCR, זה הכרחי למנוע הגברה ספציפי שעולה מפני זיהום פריימר דיימר או gDNA RNA מדגם3,15. הוא צפוי כי טיפשה או רמות תעתיק רנ א תחת זיהום gDNA8. . כאן, המאפיינים הייחודיים של ג’ין rDNA נחשב עבור assay זיהום gDNA בדגימות ה-RNA.
מאפיינים בסיסיים של rDNA בשימוש פרוטוקול זה: גנים ribosomal מורכב פירמת שני, כלומר ITS1 ITS2, ואת הגנים קידוד שלושה rRNA, 17-18S, 5.8S, ו- 25-28S יחידת משנה12. האזורים ITS שני הם לא חלק רצף subunits ribosomal קידוד. הם מוסרים לפחות שלוש פעילויות אנזימטיות לעבד למבשר להבשיל rRNA: פעילות endonuclease הליקאז, אקסונוקלאז. כמו ribosomal RNA הוא עיבד בתור תעתיק polycistronic, מוצר ראשי המכיל את פירמת קיים בהחלט. העיבוד הוא מהר מאוד וזה מתרחש גרעינון, הסכום של קודמן לזיהוי מולקולות המכילות את ITS מתחת לגבול זיהוי של השיטה qPCR. לכן, כאשר ITS1 או ITS2 הם מוגבר על-ידי ITS איגוף תחל, הגברה לא ניתן להבחין בדגימות ה-RNA אלא אם קיים זיהום gDNA. מספר גנים rDNA הגנום של היצורים האיקריוטים הוערך לכלול עד אלף עותקים, אשר מסודרים מערכים יחיד או טנדם על כרומוזום11. ב פרוטוקול זה, אנו מציעים דרך חלופית, במקום NRT, כדי לזהות זיהום gDNA, אשר נמצא בשימוש בכל תגובה/assay.
יתרונות ומגבלות לגבי שיטות קיימות: NRT משמש בדרך כלל כדי לבדוק אם המדגם RNA מוכן הוא נקי או מזוהמים על-ידי gDNA. כיוון gDNA זיהום לא מופץ בצורה אחידה בין מדגמים שונים של RNA, תגובת רגישות gDNA מושפע באופן משמעותי הגנים מנותח, פקדים NRT נדרשים עבור כל זוג מדגם/assay7,15. זה יוסיף באופן משמעותי את עלות, העבודה בעת טיפול רבים דוגמאות בו זמנית3,9. שיטות אלטרנטיביות אחרות מתועדים בספרות כוללים שימוש אינטרון תחל ספציפי עבור הגילוי של gDNA, או תחל בעיצוב לאגף אינטרון או span של צומת אקסון-אקסון. המגבלות של שיטות אלה נובעות אי זמינות של שמידע רצף אינטרון ביאור לא שלם של אקסון אינטרון/מבנה, העדר אינטרונים בגנים או pseudogenes של עניין1,4,10 . בגלל האבולוציה, קיימים גנים rDNA משפחות גנים multigene הגדול יצורים עילאיים, שנשמרת מאוד. הם מאוד שופע הגנום, נוכח על כרומוזומים שונים13. לעומת גנים אחרים קידוד או nonconding, הגנים rDNA להראות מיטבית עבור זיהוי של זיהום gDNA. בניתוח השוואתי transcriptomic, נירמול הנתונים qPCR על ידי כיל rRNA אינה מומלצת עבור כמה בעיות, כגון הבדלים cDNA הכנה (תיקים עשויים לקרקע לעומת לקרקע hexamer אקראיים), הבדלים גדולים בשפע בין rRNA mRNA , ותוצאות להן שונים אשר עשויה ליצור מטעה10,16. עם זאת, הבעיות שהזכרנו רק הן יתרון עבור וזמינותו זיהום gDNA. לדוגמה, ביחס גבוה יותר שפע באתר מיקוד הגנום ולאחר לוקליזציה על כרומוזומים שונים, תחל מבוססי rDNA לשפר באופן משמעותי את הרגישות זיהוי של gDNA לעומת שיטות קיימות.
Versality של rDNA-מבוסס על אורגניזם אחר: rDNA גנים הם משפחה גן למד היטב שזוהתה רוב האורגניזמים. השיטה המוצעת מבוססת rDNA מייצג מערכת פשוטה, רגישה מאוד וכלכלי עבור מבחני זיהום gDNA אשר ניתן להתאים בקלות אורגניזמים אחרים האיקריוטים ו- prokaryotic (פרוטוקול 2 – 5). כמקרה, הראו כאן השירות של שיטה זו של מינים מסוימים Poceae (איור 4 , איור 5). צבעי יסוד בשימוש מראים שיעור גבוה של transferability למינים אחרים Poceae ‘ בזכות מבנה מאוד שנשמרת rDNA subunits בין המינים. בעיה זו הופך חשובה אף יותר כאשר מידע רצף גנומית מספיק אינה זמינה עבור עיצוב פריימר. לפיכך, ITS-איגוף תחל מיועד מין אחד יכול לשמש במינים קרובים. כמו כן, 5.8S-F/R תחל היו בחרה מבוסס על מוטיב שנשמרת המציגה דמיון גבוה צמחים פורחים רוב14. למרות תפוקה גבוהה רצף טכניקות לצמיתות להגדיל את המספר של הגנום הידועים, הביאור אקסון-אינטרון של רוב האורגניזמים לא הושלמה, אז זה לעתים קרובות לא ניתן לעצב תחל כדי להתפרס גבול אקסון-אקסון. השיטה שלנו מסביר איך מבוסס על rDNA תחל יכול להיות מיושם עבור וזמינותו זיהום gDNA בניתוח qPCR ושל אאוקריוטים פרוקריוטים עם המטרה של חיסול פקדים NRT יקר בכל שילוב assay/פריימר.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי הגנטי, חקלאות ביוטכנולוגיה המכון של יזד (GABIT), מדעי החקלאות סארי משאבים טבעיים האוניברסיטה (SANRU). קבוצת המחקר ג’וניור גנומיקה מתח והאביוטיים מומן על ידי IZN (המרכז למחקר הצמח יבול, האלי (Saale), גרמניה. אנו מודים רונדה מאייר על קריאה ביקורתית של כתב היד.
Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K0221 | |
TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | K1631 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
96 well WHT/CLR | Bio-Rad | HSP9601 | |
Microseal B film | Bio-Rad | MJ-0558 | |
Low tube strip CLR | Bio-Rad | TLS0801 | |
Flat cap strips | Bio-Rad | TCS0803 | |
NanoDrop 2000 | Peqlab | ND-2000 | |
RNaseZAP | Ambion | 9780 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
RNase A, DNase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0523 | |
TRIZOL Reagent | Ambion | 15596026 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BIO RAD | 1855195 | |
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
Guanidine thiocyanate for molecular biology | Sigma-Aldrich | G9277 | |
Agarose – Nucleic Acid Electrophoresis | Sigma-Aldrich | A9414 | |
Boric Acid for molecular biology | AppliChem | A2940 | |
bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
ethidium bromide | AppliChem | A1151 | |
Gel documentation system | BIO RAD | Gel Doc 2000 |