Summary

La incubación prolongado de aguda neuronal de tejidos para la Sección de Electrofisiología y calcio de imágenes

Published: February 15, 2017
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Summary

Una vez retirado del cuerpo, el tejido neuronal se ve afectada en gran medida por las condiciones ambientales, lo que lleva a una eventual degradación de los tejidos después de 6-8 h. Utilizando un método de incubación única, que sigue de cerca y regula el ambiente extracelular de los tejidos, la viabilidad del tejido se puede ampliar de manera significativa para> 24 h.

Abstract

Aguda preparaciones de tejidos neuronales, rodajas de cerebro y de la retina wholemount, por lo general sólo puede ser mantenido durante 6 – 8 h después de la disección. Esto limita el tiempo experimental, y aumenta el número de animales que se utilizan por estudio. Esta limitación específicamente impactos protocolos tales como imágenes de calcio que requieren pre-incubación prolongada con tintes de baño-aplicado. crecimiento bacteriano exponencial dentro de 3 – 4 h después de cortar está estrechamente correlacionada con una disminución de la salud de los tejidos. Este estudio describe un método para limitar la proliferación de bacterias en preparaciones agudas para mantener el tejido neuronal viable durante periodos prolongados de tiempo (> 24 h) sin la necesidad de antibióticos, los procedimientos estériles, o medios de cultivo de tejidos que contienen factores de crecimiento. Ciclando el fluido extracelular a través de la irradiación UV y mantener el tejido en una cámara de retención de encargo en 15 – 16 ° C, el tejido no muestra diferencias en las propiedades electrofisiológicas, o si calciognaling a través de colorantes de calcio intracelular en> 24 h postdissection. Estos métodos no sólo extender el tiempo experimental para aquellos que utilizan tejido neuronal aguda, pero se reducirá el número de animales necesarios para completar objetivos experimentales, y establecerá un estándar de oro para la incubación del tejido neuronal aguda.

Introduction

Electrofisiología y la imagen funcional (calcio, colorantes sensibles al voltaje) son dos de las técnicas experimentales más utilizados en la neurociencia. preparaciones de cortes de cerebro y de la retina wholemount, que será examinada aquí, proporcionan un medio de examinar las propiedades electrofisiológicas y conectividad sináptica y sin contaminación de anestésicos o relajantes musculares. Rodajas de cerebro y de la retina wholemount mantienen su integridad estructural, a diferencia de las culturas o los homogeneizados celulares, permitiendo el estudio de los circuitos cerebrales específicos y redes 1. Las grabaciones de tejido aislado tienen ventajas sobre las grabaciones en vivo como los movimientos asociados con el latido del corazón y la respiración se eliminan. Por otra parte, la visualización directa permite que las clases específicas de células para ser dirigidos, y la aplicación local de herramientas farmacológicas 2, 3.

patch-clamp grabaciones y Calcio tinte de carga en wholemount retina se complica por la existencia de la membrana limitante interna (ILM), que cubre la capa de células ganglionares de la retina (RGC) e impide el acceso directo a las células. Típicamente, esta membrana se raspa con una pipeta de vidrio para permitir la aplicación directa de una pipeta de parche y la formación de un sello gigaohmio en una sola célula. Además, los colorantes de calcio de baño aplicado no cruzan la ILM y, o bien deben ser inyectados debajo de esta membrana 4, retrógradamente transportado después de la inyección en el nervio óptico 5 o electroporación a través del tejido 6. Por otra parte, cuando se utiliza un modelo de roedor de la retinitis pigmentosa, el ratón rd / rd, la ILM es más gruesa y más impenetrable. Aquí, nosotros usamos una técnica para eliminar la ILM con la digestión enzimática 7, para permitir tanto ubicua de calcio colorante de carga, y el acceso directo a las células ganglionares de la retina para recordi patch-clampNGS 8.

grabaciones de éxito de cualquiera de las secciones de cerebro o de la retina wholemount dependen de la disección y la incubación del tejido neuronal viable. Típicamente, el tejido se extrae en la mañana del experimento y se incubó en fluido cerebroespinal artificial (ACSF) hasta que se utiliza para las grabaciones. Por lo general, el tejido sigue siendo viable durante 6 – 8 h, con una degradación significativa después de esta ventana de tiempo. Sin embargo, ambas secciones de cerebro y preparados retinae wholemount suelen producir más tejido que puede ser grabado desde dentro de este período de tiempo corto. En consecuencia, el tejido a menudo se desecha al final del día y la disección se completa de nuevo en días posteriores. Esto significa otro animal y se utiliza ~ 2 h de la configuración y la disección / tinción repetida. El siguiente protocolo describe un método para extender la vida de tejido neuronal durante más de 24 h, lo que significa un menor número de animales se utilizan, y el tiempo más experimental está disponible. Viabilidad del tejido wcomo se evaluó a través de la grabación de las propiedades electrofisiológicas y la dinámica del calcio, y estas propiedades eran indistinguibles entre <4 hy> 24 h postdissection.

Estos resultados indican que no sólo tienen una propiedad de una sola célula intacta y funcional después de una incubación prolongada, pero la actividad de la red, según la evaluación de calcio de imágenes y registros electrofisiológicos, es sin cambios> 24 h postdissection. Por otra parte, se muestra que los colorantes de calcio pueden permanecer en las células durante períodos prolongados sin causar efectos perjudiciales. La aplicación de este protocolo demuestra que la actividad funcional de las neuronas en el tejido neuronal aguda puede mantenerse durante largos períodos de tiempo, una vez que el entorno externo es altamente regulado. Además, como la viabilidad del tejido varía mucho entre laboratorios debido a diferentes protocolos de incubación, este método establece un estándar de oro para los parámetros ideales que se deben aplicar para reducir la variabilidad en la salud de neu agudaRonal tejido.

Protocol

El protocolo siguiente se describe la preparación de C57BL / 6 y C3H / He (retinally degenere) tejido neuronal de ratón, pero las técnicas similares puede aplicarse a otras especies. Todos los animales estaban sanos y tratarse con las condiciones normales de temperatura, humedad, 12 h ciclo luz / oscuridad, el acceso libre a comida y agua, y sin ningún tipo de estímulos de estrés previstos. Todos los experimentos fueron aprobados y realizados de acuerdo con el comité de la Universidad de Western Sydney Cuidado de Animales y Ética y …

Representative Results

estrecha regulación de la carga bacteriana y la temperatura del LCRa durante la incubación es esencial para mantener la viabilidad del tejido neuronal. Esto puede ser optimizado a través de irradiación con luz UVC y manteniendo la temperatura de la LCRa a 15 – 16 ° C (Figura 1). Por otra parte, la ACSF Parámetros de sello (APS; Figura 1C) proporciona el experimentador con un registro de las condiciones ambientales (pH y temperatura.), Lo que ofrece…

Discussion

Este artículo describe un método de incubación de extender la viabilidad del tejido neuronal aguda para los experimentos de formación de imágenes y electrofisiológicos, reduciendo así el número de animales necesarios para completar objetivos experimentales. Dos procesos principales gobiernan el deterioro del tejido neuronal a través del tiempo: i) el aumento de los niveles de bacterias, y el consiguiente aumento de la endotoxina bacteriana liberado, y ii) la excitotoxicidad que sigue el procedimiento de corte t…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).

Materials

Sodium Chloride Sigma Aldrich VETEC V800372
Potassium chloride Sigma Aldrich P9333
N-Methyl-D-glucamine Sigma Aldrich M2004 
D-glucose Sigma Aldrich G5767
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6014
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich S2554
Magnesium chloride Sigma Aldrich M9272 
Calcium chloride  Sigma Aldrich 223506
Papain Dissociation System Worthington  LK003150
Dimethyl sulfoxide anhydrous Sigma Aldrich 276855
Pluronic F-127 Low UV absorbance* Life technologies P-6867 20% solution in DMSO 
Fura-2 AM   Anaspec 84017
Fluo-4 AM   Life Technologies F23917
Fluo-8 AM Abcam Ab142773
Vibrating blade microtome  Leica Biosystem VT1200 S Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device 
Antivibration table Kinetic Systems Vibraplane  Vibraplane 9100/9200 
Fixed Stage Upright Microscope Olympus BX51WI 
Microscope Objective Olympus XLUMPlanFLN 20x/1.00w 20X 
Microscope Objective Olympus LUMPlanFLN 60x/1.00w 60X
CCD Camera Andor Ixon +
High speed wavelength switcher Sutter instrument Lambda DG-4 
Patch clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Borosilicate glass capillaries Sutter Instrument Co BF150-86-10
Microelectrode puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-40LP Low Profile Open Bath Chambers
Software Molecular Devices pClamp 10.2
Andor iQ Live Cell Imaging Software Andor Andor iQ3
Braincubator Payo Scientific BR26021976 www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler TE Technology CP-121
Temperature Controller TE Technology TC-36-25 RS232

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Cameron, M. A., Kekesi, O., Morley, J. W., Bellot-Saez, A., Kueh, S., Breen, P., van Schaik, A., Tapson, J., Buskila, Y. Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. J. Vis. Exp. (120), e55396, doi:10.3791/55396 (2017).

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