Длительная инкубация Острый нейронную ткань для электрофизиологии и кальций-изображений

Электрофизиологии и функциональной визуализации (кальций, напряжение чувствительных красителей) являются одними из наиболее часто используемых экспериментальных методик в области неврологии. Мозговые препараты срезов и Wholemount сетчатки глаза, который будет рассмотрен здесь, служат средством изучения электрофизиологических свойств и синаптические соединения без загрязнения от анестетиков или мышечных релаксантов. Мозговые срезы и сетчатки глаза Wholemount сохраняют свою структурную целостность, в отличие от культур клеток или гомогенатах, что позволяет изучение конкретных цепей и сетей мозга ^1. Записи из изолированной ткани имеют преимущества по сравнению с записями в естественных условиях , как движений , связанных с сердцебиением и дыханием устраняются. Кроме того, прямая визуализация позволяет определенные классы ячеек для адресных и местное применение фармакологических средств ^{2, 3.}

Патч-зажим записи и известковоНМУ краситель загрузкой в ​​Wholemount сетчатки глаза осложняется наличием внутренней ограничивающей мембраны (ILM), который покрывает слой ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) и предотвращает прямой доступ к клеткам. Как правило, эта мембрана разгреб со стеклянной пипеткой для прямого применения заплатки пипеткой и формирования gigaohm печатью на одной ячейке. Кроме того, ванны с нанесенным красители кальция не пересекают ILM и либо должен быть введен под этой мембраной ^4, ретроградно транспортируются после инъекции в зрительный нерв ⁵ или электропорации через ткань ^6. Кроме того, при использовании грызуна модель пигментный ретинит, то й / й мышь, ILM толще и более непроницаемой. Здесь мы используем технику для удаления ILM с ферментативным расщеплением ^7, чтобы обеспечить как вездесущий кальция краситель-налива, а также прямой доступ к ганглиозных клеток сетчатки для патч-зажим recordiNGS ^8.

Успешные записи либо из срезов головного мозга или Wholemount сетчатки зависят от рассечения и инкубации жизнеспособной нервной ткани. Как правило, ткань извлекают утром эксперимента и инкубируют в искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF) до тех пор, пока используется для записей. Как правило, ткань остается жизнеспособной в течение 6 – 8 ч, со значительным ухудшением следующего временного окна. Тем не менее, оба срезах мозга и Wholemount препараты сетчатке обычно производят больше ткани, чем может быть записан с в течение этого короткого периода времени. Следовательно, ткань часто отбрасываются в конце дня и рассечение завершается снова в последующие дни. Это означает, что используется другое животное и ~ 2 ч установки и рассечение / окрашивания повторяется. Следующий протокол описан способ продления срока службы нервной ткани в течение более 24 ч, а это означает меньше животных используются, и более экспериментальное время доступно. Ткань жизнеспособность шкак оценено посредством записи электрофизиологических свойств и динамики кальция, и эти свойства были неотличимы от <4 ч и> 24 ч postdissection.

Эти результаты указывают на то, что не только единичные свойства ячеек нетронутыми и функциональный после длительной инкубации, но сетевую активность, как оценено с помощью кальций-визуализации и Электрофизиологические записи, неизменна> 24 ч postdissection. Кроме того, показано, что красители кальция может оставаться в клетках в течение длительных периодов, не вызывая каких-либо отрицательных последствий. Применение этого протокола свидетельствует о том, что функциональная активность нейронов в острой нервной ткани может сохраняться в течение длительного времени после того, как внешняя среда сильно регулируется. Кроме того, как жизнеспособность тканей очень широк и варьируется между лабораториями в связи с различными протоколами инкубации, этот метод устанавливает золотой стандарт для идеальных параметров, которые должны применяться для снижения изменчивости в здоровье острого NeuRonal ткани.