(Rana catesbeiana) sáculo de la rana toro americana permite el examen directo de la fisiología de las células del cabello. A continuación se describe la disección y preparación del sáculo de la rana toro para estudios biofísicos. Mostramos experimentos representativos de estas células, incluyendo el cálculo de la relación fuerza-desplazamiento de un paquete y la medición de su movimiento no forzado.
El estudio de la audición y el equilibrio se basa en ideas extraídas de los estudios biofísicos de los sistemas modelo. Uno de estos modelos, el sáculo de la rana toro, se ha convertido en un pilar de la investigación auditivo y vestibular. Los estudios de este órgano han puesto de manifiesto cómo las células sensoriales del cabello puede detectar activamente señales del entorno. Debido a estos estudios, que ahora entendemos mejor la compuerta mecánica y localización de los canales de transducción de una célula de pelo, el papel del calcio en la adaptación mecánica, así como la identidad de las corrientes de células ciliadas. Este órgano muy accesible continúa proporcionando información sobre el funcionamiento de las células ciliadas. Aquí se describe la preparación de sáculo de la rana toro para estudios biofísicos en sus células ciliadas. Incluimos el procedimiento de disección completa y proporcionar protocolos específicos para la preparación del sáculo en contextos específicos. Además incluimos resultados representativos que utilizan esta preparación, incluyendo el cálculo deinstantáneo relación fuerza-desplazamiento de un haz de pelo y medida de la oscilación espontánea de un paquete.
Los órganos acousticolateralis de mamíferos poseen una arquitectura compleja y se encuentran dentro de un nicho anatómica que puede ser de difícil acceso. Por ejemplo, la cóclea de los mamíferos comprende un laberinto en espiral y está insertada dentro del hueso temporal de espesor. Aislamiento de la cóclea a menudo causa daño mecánico a las células sensoriales que están dentro de ella y, por tanto, ha demostrado ser una tarea difícil 1. por tanto, los neurocientíficos han recurrido a modelar sistemas que se extraen más fácilmente desde el santuario de la oreja.
Uno de estos sistemas modelo, el sáculo de la rana toro (Rana catesbeiana), tiene desde hace décadas dieron una visión generalizables a la función de los sistemas auditivos y vestibulares. El sáculo es un órgano de función mixta con funciones sensoriales en tanto audiencia de baja frecuencia y la sensación sísmica. Las células sensoriales del sáculo son sus células ciliadas, transductores especializados que convierten la energía mecánicaen señales eléctricas dentro de nuestros órganos auditivos y vestibulares. Sobresalen de la superficie apical de cada célula del cabello es un haz de pelo mechanosensitive que comprende un mechón graduada de microvellosidades ampliada llamado estereocilios. Las puntas de los estereocilios adyacentes están interconectados por proteínas punta de enlace filamentosos que mecánicamente los canales de iones de compuerta en respuesta a los estímulos mecánicos 2, 3. Aunque los órganos auditivos y vestibulares responden a diferentes tipos de estímulos, comparten un mecanismo de detección común. Esta coincidencia subyace en los conocimientos adquiridos en muchos mechanotransduction de células cabello a través de estudios de la rana toro sáculo. Por ejemplo, proceso activo de la célula de pelo se ha estudiado ampliamente en este órgano 4, 5, 6, 7, y el haz de pelo emplea un proceso que consume energía para producir mecánicotrabajo. No sólo se ha demostrado que las células ciliadas generan trabajo activo 6, pero distintos mecanismos que subyacen al proceso activo y las características de sintonización de una célula de pelo se han dado a conocer a través de estudios de rana toro acousticolateralis órganos. Estos incluyen activo pelo de haz de la motilidad 8 y las células ciliadas de resonancia eléctrica 9, 10, 11 en el sáculo y la selectividad de frecuencia en la sinapsis de la cinta de la célula de pelo 12 en la papila anfibio.
sáculo de la rana toro hace un llamamiento a los neurólogos sensoriales por numerosas razones. A diferencia de la cóclea de los mamíferos, este órgano se encuentra dentro de la cápsula ótica fácilmente accesible. En segundo lugar, las células ciliadas dentro de este órgano puede mantenerse saludable durante varias horas en condiciones apropiadas 13, 14. Esto permite experimentation sobre estas células a través de largas escalas de tiempo en relación con sus homólogos de mamíferos. En tercer lugar, el órgano tiene poca curvatura, lo que permite una fácil manipulación. En cuarto lugar, cada órgano comprende un millar o más células ciliadas 15, proporcionando un alto rendimiento y una alta probabilidad de localizar un conjunto apropiado de las células ciliadas para un experimento dado. Finalmente, sáculo de la rana toro se visualiza fácilmente debido a la delgadez de este órgano y el gran tamaño de sus células de pelo.
Estas propiedades proporcionan una gran versatilidad para el estudio de las células sensoriales dentro sáculo de la rana toro. Dependiendo de la pregunta a la mano, una de las diversas preparaciones experimentales se puede obtener de la sáculo. La más simple de éstas es la preparación de una sola cámara. Aquí el sáculo se inmoviliza en una cámara llena de perilinfa artificial, una solución salina rica en sodio y alto contenido de calcio. Esta preparación permite el estudio de las corrientes de células ciliadas y mecánica básica haz de pelo. Una segunda configuración, la preparación de dos cámaras, se puede utilizar para estudiar los movimientos espontáneos haz de pelo. Aquí el lado apical de las células ciliadas se expone a una solución salina rica en potasio y calcio de los pobres denominado endolinfa artificial, mientras que el lado basolateral está bañado por la perilinfa artificial. Estos dos compartimientos imitan la disposición in vivo de salines y proporcionan un entorno que permite haces de pelo oscilen de forma espontánea.
Se describe en este artículo la preparación del sáculo de la rana toro para el estudio biofísico de sus células ciliadas sensoriales. En primer lugar, ofrecemos una descripción detallada del aislamiento de este órgano del oído interno de la rana. A continuación describimos tanto el uno y dos de la cámara de preparaciones experimentales e incluir los resultados representativos para cada configuración.
Dentro sáculo de la rana toro se encuentran varios miles de células ciliadas sensoriales de fácil acceso. Aquí se demuestra la extracción y la preparación del sáculo para las grabaciones de una y de dos cámaras. Estas dos preparaciones permiten ambos estudios micromecánica y electrofisiológicas de las células ciliadas y sus paquetes asociados. Debido a que el tejido puede sobrevivir durante varias horas con el reemplazo frecuente de solución salina oxigenada, los experimentos pueden continuar durante largos períodos de tiempo. Las células pilosas en estas preparaciones normalmente permanecen viables durante la grabación de microelectrodos para un máximo de 6 h después de la disección, mientras haces de pelo oscilan de forma espontánea hasta 24 h después de la extracción.
extracción exitosa y montaje del sáculo gira en torno a la superación de varios problemas comunes. En primer lugar, el contacto directo con la superficie apical de la mácula sacular debe ser evitado en todo el procedimiento de preparación. El nervio sacular proporciona un mango conveniente para manipu seguramento del sáculo. Una vez liberado del resto de los órganos del oído interno, el sáculo debe ser transferido utilizando una pipeta de gran calibre sin dejar de ser sumergido en el fluido para evitar daños mecánicos a su epitelio sensorial. La eliminación de otoconia de la superficie macular debe ser completado sin daño mecánico a las células de pelo. Debido a que el otoconias se encuentran directamente sobre la mácula, las células ciliadas pueden ser dañados por el contacto accidental entre las herramientas de disección y la membrana otolítica mientras se quita la otoconias. Para evitar daños, se recomienda que la masa gelatinosa de otoconias llevará a cabo en un lugar lejos de la mácula y se retira como una sola masa. Esto evita la fragmentación de la masa otoconiales en numerosos grupos, cada uno de los cuales se pueden extraer individualmente. Si pequeños grupos de otoconia permanecen se pueden eliminar con la presión de fluido suave entregado por una pipeta Pasteur. Un desafío final implica la formación de un sello hermético entre la plaza sáculo y aluminio de montaje en elpreparación de dos cámaras. El empleo de un cuadrado con una perforación suficientemente pequeño para permitir la superposición de alrededor de 100 micras entre el sáculo y los permisos de aluminio de hermeticidad circundante completa del tejido. La cola debe ser puesto en contacto con aproximadamente 100 micras de tejido sacular alrededor del perímetro de la mácula con el fin de formar un sello hermético.
La concentración de Ca 2+ libre es una consideración importante en el estudio de las células ciliadas. Ca 2+ regula la adaptación a la vez rápido y lento, determinando así la cinética de la aparato mechanotransduction y las características de los fenómenos-proceso activo del haz de pelo, incluyendo espontánea movimiento paquete 8, 23. Endolinfático calcio in vivo está presente en 250 M, por lo tanto, la cinética más fisiológicamente relevantes son evaluados en esta concentración (Maunsell JHR, R. Jacobs, y AJ Hudspeth. Unpublisobservaciones HED 16). Sin embargo, las grabaciones de microelectrodos de células ciliadas requieren una concentración de calcio exterior superior a 2 mM para el sellado adecuado de la membrana celular alrededor del microelectrodo. Por tanto, es imperativo el uso de una solución salina alto contenido de calcio para estos experimentos. Por último, se puede desear para estudiar los efectos del calcio externo sobre mechanotransduction usando una variedad de concentraciones de calcio. En estos casos, es importante recordar que las concentraciones de calcio por debajo de 1 mM suelen conducir a la punta de enlace de la ruptura y la pérdida irreversible de transducción 28.
Las dos preparaciones experimentales descritos aquí permiten una gama de mediciones biofísicas en las células de pelo. Sin embargo, las mediciones adicionales pueden hacerse con ligeras modificaciones a estas preparaciones. En la preparación sacular plegada, mechones de cabello se visualizan lateralmente. De imágenes de movimiento del pelo-haz desde este punto de vista revela mot coherentede iones de muy poca altura y 29 estereocilios. Aquí la mácula sacular se separa primero a partir de su tejido subyacente y posteriormente plegada a lo largo del eje definido por el nervio sacular tal que haces de pelo se enfrentan hacia el exterior y se visualizan lateralmente en el pliegue. Una segunda modificación, la disociación de las células de pelo, permite el estudio tanto de haz de la célula de pelo y su soma. Las células ciliadas se disocian mecánicamente sobre un portaobjetos de vidrio para la formación de imágenes y grabación electrofisiológica 30. Por último, las células ciliadas se pueden extruir a partir del epitelio siguiendo un protocolo de disociación similar pero sin la etapa de disociación mecánica. Este tratamiento resulta en células de pelo que sacan gradualmente del epitelio, que proporciona acceso basolateral para los registros electrofisiológicos y reducir al mínimo los daños mecánicos. Estas preparaciones y sus muchas modificaciones demuestran la versatilidad del sáculo rana como un sistema modelo para la biofísicaestudio de las células ciliadas sensoriales.
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to acknowledge Dr. A. J. Hudspeth for funding and expertise in developing the preparations described in this paper. We also wish to thank Brian Fabella for creating and maintaining much of the custom equipment and software used in this protocol.
J. B. A. is supported by grant F30DC014215, J. D. S. is supported by grant F30DC013468, and both J. B. A. and J. D. S. are supported by grant T32GM07739 from the National Institutes of Health.
Common to both preparations | |||
Stereo-dissection microscope | Leica | MZ6 | Other sources can be used |
Tricaine methanesulfonate | Sigma | E10521 | Other sources can be used |
Metal pithing rod | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Glass Pasteur pipette and bulb (x2) | Fisher Scientific | 22-042816 | |
Fine eyelash mounted on a hypodermic needle | Fisher Scientific | 22-557-172 | |
Dow-corning vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | |
Syringe for vacuum grease | Fisher Scientific | 14-829-45 | Other sources can be used |
35 mm Petri dish (x2-3) | Fisher Scientific | 08-772A | Other sources can be used |
Micropipette puller | Sutter | P-97 or P-2000 | |
120 V Solenoid puller | Home-made, see parts list | ||
Sputter coater | Anatech USA | Hummer 6.2 | |
Current source for iontophoresis | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Other sources can be used |
Piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | P-150-00 | |
Amplifier for piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | ENV800 | |
Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B120F-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For one-chamber preparation | |||
Microelectrode amplifier | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously |
Magnetic pins (x2) | Home-made, see parts list | ||
Open-top chamber with magnetic sheet | Home-made, see parts list | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For two-chamber preparation | |||
Upper chamber | Supplementary file 1 | ||
Troughed lower chamber | Supplementary file 2 | ||
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Other sources can be used |
Mounting block | Supplementary file 3 | ||
Wooden applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | Other sources can be used |
Teflon sheet | McMaster-Carr | 8545K12 | For teflon applicator |
Cyanoacrylate glue | 3M | 1469SB | |
Lab tissues (Kimwipes) | Fisher Scientific | 06-666A | Other sources can be used |
Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Other sources can be used |
Quick-setting epoxy | McMaster-Carr | 7605A18 | |
18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-546 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Saline components | |||
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Other sources can be used |
KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | Other sources can be used |
CaCl2 • 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Other sources can be used |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | Other sources can be used |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Parts lists for home-made equipment | |||
Solenoid puller | |||
Solenoid | Guardian Electric | A420-065426-00 | Other sources can be used |
Foot-pedal switch | Linemaster | T-51-SC36 | Other sources can be used |
Pipette holder | World Precision Instruments | MEH900R | Other sources can be used |
Coarse manipulator | Narishige Group | MM-3 | Other sources can be used |
Platinum wire | Alfa Aesar | 25093 | Other sources can be used |
Power supply | Leica | Z050-261 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Magnetic pins | |||
Epoxy | McMaster-Carr | 7556A33 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
Insect pins | Fine Science Tools | 26000-40 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Open-top magnetic chamber | |||
Flexible magnetic strip | McMaster-Carr | 5759K75 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |