미국 황소 개구리의 Sacculus (헤어 세포의 생리 준비<em> 모이 catesbeiana</em>)

윤리 정책 : 모든 절차는 록펠러 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 1. 사전 실험 Prespanparation 솔루션 유게 놀 솔루션을 준비 (2.5 g · L -1 · kg -1 개구리). 식염수 용액 (표 1)을 준비합니다. 참고 : 하나의 챔버 준비를 들어, 인공 외 림프를 준비; 두 챔버 준비를 위해, 인공 외 림프 및 인공 림프을 모두 준비합니다. 2. 실험 도구 자극 유리 섬유의 제조 고온과 높은 속도로 한 줄 당김의 전극 풀러와 붕규산 유리 모세관을 좁 힙니다. 솔레노이드 구동 풀러에 뽑아 모세관을로드합니다. 유리 비드 필라멘트쪽으로 모세관의 끝 부분을 가지고모세관 콘택트 유리 비드까지 용융 상. 유리 구슬로 모세관의 끝 부분을 용융 필라멘트를 켭니다. 모세관과 구슬 사이의 유리 형태의 얇은 다리되면, 필라멘트 전원을 끄고 같은시기에 솔레노이드 풀러를 활성화합니다. 참고 :이 긴 축에 직각으로 유리 모세관을 당겨 단단한 섬유를 생성합니다. 섬유의 직경이 더 이상 0.5 있는지 확인 – 1 ㎛는 그 길이가 100을 초과하지 않는 – 300 μm의. 섬유의 길이가이 치수를 초과하는 경우, 홍채 가위를 트리밍. 이미 해부 도구의 손상을 방지 할 수 둔한 있습니다 가위를 사용합니다. 광학 대비를 향상시키기 위해 코트를 섬유 스퍼터. 금 – 팔라듐 소스와 스퍼터 코터를 사용합니다. 수직 원본으로의 테이퍼 끝 스퍼터 코터로 각 섬유를로드합니다. 금 – 팔라듐 소스에서 2cm – 하나의 거리에 섬유의 팁을 가져옵니다. 닫습니다시일을 형성하고 전원을 켜 코터의 챔버를 스퍼터. 반복 아르곤으로 주변 공기를 세척합니다. 공기 세척 한 후, 10 파 (70 mTorr 이하)을 챔버 내의 압력을 감소시킨다. 120 s의 과정을 통해 10 초 지연으로 10 초 펄스에서 코트를 스퍼터. 주 : 스퍼터 코팅이 성공하면 섬유의 끝이 프로토콜의 지속 시간 동안 어둡게된다. 날카로운 미소 전극의 제조 한 줄 높은 열 풀을 사용하여 내부 필라멘트와 유리 모세관을 당겨. 3 M KCl을 가득 때 300 MΩ – 전극 (100)의 저항이 있어야합니다. 3 M KCl을 각 전극을 입력합니다. 앰프의 headstage (16)에 장착 할 때 벤드는 microforge 각 전극의 끝은 머리 세포 혀끝의 표면이 수직 렌더링합니다. 이온 토 포레 시스 피펫의 준비 내부에 유리 모세관을 당겨50 MΩ 팁 필라멘트. 농축 용질 (예를 들어, 500 밀리미터가 황산 젠타 마이신)를 입력합니다. 알루미늄 장착 광장의 준비 알루미늄 호일의 1cm X 1cm 사각형을 잘라. pithing로드 또는 다른 날카로운 물체의 끝 중앙에 호일을 관통. 그것은 원형 직경 약 1mm가되도록 관통 구멍을 형성. 진공 그리스 충전 된 주사기의 준비. 5 ML의 주사기에서 플런저를 제거합니다. 진공 그리스와 뒷면에서 주사기를 입력합니다. 플런저를 교체합니다. 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 접착제 도포의 준비 나무 주걱 스틱의 끝 부분으로 잘라 2mm 긴 축합니다. 최종에서 볼 때 슬릿은 어플리케이터의 중심에 있어야합니다. 예리한 가위 면도날, 1mm 두께의 시트로부터 폴리 테트라 플루오로 에틸렌의 2mm X 4mm 사각형을 잘라. </l난> 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 사각형의 2mm 길이의 가장자리의 얇은 하나 면도날을 사용합니다. 직사각형의 중앙에서 시작하여, 구형의 선단부에 경사면을 형성하는 외측 슬라이싱하여 직사각형의 두께를 감소시킨다. 경사 날 멀리 스틱에서 향하도록 나무 주걱 슬릿에 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 사각형을 삽입합니다. 제자리에 고정하기 위해 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 직사각형의베이스에 5 분 에폭시를 적용한다. 접착제의 도포는, 실온에서 1 시간 동안 경화 할 수있다. 두 챔버의 하부 절반의 제조 탑재 기계 또는 3D는 2 챔버의 하부 절반 (보조 파일 2)을 탑재 인쇄. 상기 챔버의 하부면에 직경 20mm 오목 원을 식별한다. 오목 원의 가장 외측에 에폭시 3mm의 얇은 층을 적용한다. 에폭시에 한 18mm 원형 유리 커버 슬립을 적용합니다. 에폭시는 1 치료 허용시간. 내부 귀 기관의 3. 추출 10 분 동안 유게 놀 마취 용액을 함유하는 작은 양동이에 배치하여 미국 Bullfrog 마취. 용액의 부피를 조정하는, 그래서 그냥 액체 무선 인터페이스 위의 개구리의 humero – 견갑골 관절 거짓말. 더블 pithing에 의해 마취 황소 개구리를 안락사. 턱 아래 하나의 코 꼭대기 손가락과 다른과 마취 개구리를 잡고 앞으로 개구리의 머리를 돌립니다. 신속 개구리의 뒤통수 프로세스 사이의 중간 선에서 발견되는 난원 매그넘을 통해 뇌 볼트에 pithing로드를 뛰어. 천천히 철회와 팁이 난원 매그넘에서 출발 할 때까지로드를 회전합니다. 척수를 파괴하는 척추 foramina을 통해 꼬리 쪽로드를 강제로. 개구리가 제대로 이중 하부 사지 연장하는 것을 관찰함으로써 pithed되었는지 확인합니다. 안정성 향상을위한 vomerine 치아를 잡고 코와 첫 번째 손가락 꼭대기 엄지 손가락으로 개구리를 잡고. 양측 턱 관절을 절단하고 이후 rostrocaudal 축에 직각으로 절단하여 개구리 목을 벨. 두개골 내 내부 귀 기관이 그대로 남아 있음을 보장하기 위해 절단 모두 tympana에 꼬리 있는지 확인합니다. stereodissection 현미경을 사용하여, 조직 (도 1a)의 가장 후방 정도로 vomerine 치아에서 구개 조직을 잘라 정중선을 실행한다. 절단 및 후방 연골을 나타 내기 위해 구개 조직 아래에 누워 메스의 수평 컷 어떤 근육을 취소합니다. 근육을 제거한 후, 귀 캡슐의 경계를 형성하는 시간 연골 사탕 형상을 관찰한다. 귀의 캡슐의 연골과의 접촉의 지점에서 코 기둥을 절단. 반복 shallo함으로써이 연골의 얇은 층을 면도그것을 통해 w 가로 잘라냅니다. 내부 귀 기관에 손상을 방지하기 위해 깊은 상처를 피하십시오. 이 시간 연골 (그림 1B)의 롤리팝 구조 내에서 발견 된 귀 캡슐을 엽니 다. 귀의 캡슐 내에서 개구리의 내부 – 귀 기관 (도 1C)입니다. 내부 귀 기관이 손상되지 않도록주의하면서 후방과 귀 캡슐의 측면 모서리를 낸다. 해부하는 동안 자주가 침수 및 수화 상태를 유지하도록 내이 기관을 통해 식염수 흐름. 중간 선에 연골의 내측 연결에서 측두골에있는 두 개의 원형 구멍을 찾습니다. 시간적 뼈 파열 가장 내측 구멍을 통해 아래로 잘라. 그 측방 가장자리에 귀의 캡슐을 통해 두 번째 아래로 절단합니다. 내부 귀 기관에 대한 액세스를 제공하기 위해 이전 컷 사이의 연골 조각을 제거합니다. 단계 3.8을에서 컷 사이의 연골을 풀어 들어 올립니다차 3.9과 귀 캡슐에서 멀리 잘라. 이 조치는 추가 조작에 대한 핸들로 사용 될 수있는 가장 가까운 반원의 운하를 벌인. sacculus를 만지지 않도록주의하면서 뇌신경 번째 VIII을 절단. 가장 가까운 반원형 운하의 팽대부를 잡으십시오. 조심스럽게 남아있는 두 개의 반원형 운하를 노출 내이을 돌립니다. 각 운하를 노출되면, 그것을 절단. 신경 또는 반원형 운하 팽대부를 잡고 머리에서 내 귀를 추출하고 냉장 산소 인공 외 림프 가득 접시에 넣습니다. 내이의 제거는 반원형 운하가 한 번 통과 한 측두골 (그림 1D) 내의 통로의 시각화를 허용합니다. 참고 : 두 번째 귀를 추출하기 위해이 단계를 반복합니다. 4. 하나의 챔버 준비 sacculus의 분리 대형 엉를 식별하여 sacculus를 찾습니다전자 이석의 질량과 그 꼭대기에 놓여 주머니 모양 신경 (그림 1E). 물리적 주머니 모양 머리 셀의 무결성을 유지하기 위해 다음 단계 중 sacculus를 상처를 입히다 않도록주의. 내이 조종 렌더링하는 반원의 운하를 낸다. sacculus의 신경 측 위에 놓인 perilymphatic 탱크를 제거합니다. 수조의 둘레 부드러운 컷을 확인합니다. 다음은 sacculus의 신경 측에 탱크의 멤브레인을 연결 조직의 작은 기둥을 절단. lagena 및 관련 신경을 제거합니다. 주머니 모양 신경 잡고 부드럽게 sacculus을 들어 올려 otoconial 낭의 얇은 막을 통해 절단. 낭 중 이석 유출 된 바와 같이, 그 둘레 절단하여 sacculus 무료. 참고 : 원하는 경우 sacculus을 분리 한 후, 나머지 내부 귀 기관이 저장 될 수 있습니다. sacculus 제거와 같은 다른 구조의 식별을 용이양서류와 기저 용의자. 조심스럽게 sacculus에 남아있는 이석을 닦아 가위 또는 집게를 사용합니다. 이 과정에서 sacculus를 만지지 않도록주의하십시오. sacculus '가장자리에서 남아있는 otoconial 골목 막 트림. 이 멤브레인은 플라스틱 및 유리 표면에 부착하는 경향과 그 제거는 조직을 취급 문제를 최소화 할 수 있습니다. 부드럽게 남아있는 이석 (그림 1 층)을 제거하기 위해 파스퇴르 피펫으로 sacculus를 통해 식염수 흐름. 참고 : 첫 번째의 미러 이미지 인 제 2 sacculus에 대해이 절차를 반복합니다. 소화 및 설치 고장의 팁 파스퇴르 피펫의 백엔드를 사용하여, 인공 외 림프 67 mg의 ∙ L -1 프로테아제 XXIV의 3 ㎖을 함유하는 페트리 접시에 절연 sacculi 옮긴다. 참고 :이 프로테아제 처리는 otolithic 각 kinociliary 전구를 테 더링의 링크를 소화막 감각 모발 다발을 손상시키지 않고 막 제거를 가능하게한다. 22 ° C (또는 21 ° C에서 35 분)에서 30 분의 조직을 품어. 오픈 직면 실험 챔버에 각각 소화 sacculus를 전송하고 자기 핀 조직을 고정합니다. 주머니 모양 황반 직접 otolithic 막 아래에 거짓말과 유모 세포를 포함하는 sacculus의 부분이다. 그것을 확인하고 조심스럽게 주머니 모양 황반를 만지지 않도록주의하면서 좋은 속눈썹을 사용하여 상부 otolithic 막을 제거합니다. 5. 두 개의 챔버 준비 sacculus의 분리 4.1 절에서와 같이 내부 귀 기관에서 sacculus을 분리합니다. 설치 및 소화 진공의 두 점을 이용하여, 인공 외 림프로 장착 블록 (보조 파일 3)를 채우고 하나의 개구부에 뚫린 알루미늄 포일을 배치제자리에 고정하고 약한 시일을 형성 그리스. 전송 한 호일에 sacculus 및 아래로 향하게 황반과 위를 향하도록 신경 밑둥에 구멍의 상단에 중심. 트위스트 조직의 조각으로 sacculus 주변의 염분을 제거합니다. sacculus을 둘러싼 알루미늄 광장의 표면을 건조 할 수있는 생리 식염수를 심지. sacculus의 가장자리와 알루미늄 평방 사이의 경계를 따라 단단한 시일을 형성하는 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용하기 위해 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 어플리케이터를 사용한다. sacculus의 전체 둘레는 접착제로 피복되어 있는지 확인합니다. 참고 : 너무 느리게 진행하는 시아 노 아크릴 레이트 접착제가 sacculus의 신경 측면을 통해 크리프 결국 그것을 커버 할 수 있습니다. 신속하게이 작업을 완료하는 것이 필수적이다. 접착제를 치료하기 위해 장착 된 조직의 위에 생리 식염수의 드롭 놓습니다. 접착제의 박막 식염수 드롭의 상부에 형성 할 수 있고; 집게로 제거합니다. 조심스럽게 t 제거그는 장착 블록에서 호일. sacculus의 황반면이 위를 향하도록 위에 장착 된 조직 플립과 인공 외 림프 채워진 페트리 접시에 떠. 황반의 상단에 단백질 분해 효소 XXIV 용액 한 방울을 추가하고 22 ° C (또는 21 ° C에서 35 분)에서 30 분 동안 품어. 중앙 챔버 주위에 외 림프와 장소 진공 그리스와 두 개의 챔버 장치 (보조 파일 2)의 하부 운하를 입력합니다. 챔버의면에 대향하는 신경과 하부 챔버에 호일 장착 sacculus를 놓습니다. 호일의 둘레 그리스를 추가합니다. 진공 그리스와 완벽한 밀봉을 형성하도록주의하면서 호일에 준비의 상부 챔버 (보충 파일 1)을 놓습니다. 버블 인공 림프와 상부 챔버를 입력하고 부드럽게 속눈썹으로 otolithic 막을 제거합니다.