Amerikan Bullfrog of sacculus (Saç Hücrelerinin fizyolojik hazırlanması<em> Rana catesbeiana</em>)
Summary
Amerikan bullfrog en (Rana catesbeiana) sakkuluslar saç hücre fizyolojisinin doğrudan muayene izin verir. İşte diseksiyon ve biyofiziksel çalışmaları için Bullfrog en sacculus hazırlanması tarif edilmektedir. Biz onun unforced bir hareket Paketin kuvvet-deplasman ilişkisi hesaplanması ve ölçümü de dahil olmak üzere, bu saç hücrelerinden temsili deneyler göstermektedir.
Abstract
işitme ve denge çalışma modeli sistemlerinde biyofiziksel çalışmalardan alınan bilgilerle üzerine oturmaktadır. Böyle bir model Amerikan bullfrog sakkuluslar, işitsel ve vestibüler araştırma bir dayanak noktası haline gelmiştir. Bu organın Çalışmalar aktif ortamdan sinyalleri tespit nasıl duyusal hücrelerin saç ortaya koymuştur. Çünkü bu çalışmaların, şimdi daha iyi mekanik yolluk ve saç hücrenin transdüksiyon kanalları, mekanik uyarlamasında Kalsiyum rolü lokalizasyonu ve saç hücresi akımların kimliğini anlıyorum. Bu son derece erişilebilir bir organ saç hücrelerinin işleyişini içgörü sağlamaya devam etmektedir. Burada da saç hücreleri üzerinde biyofiziksel çalışmalar için BULLFROG en sacculus hazırlanmasını tarif etmektedir. Biz tam diseksiyon prosedürü içeren ve belirli bağlamlarda sacculus hazırlanması için özel protokolleri sağlar. Biz ayrıca hesaplanması dahil olmak üzere bu hazırlık kullanılarak temsilcisi sonuçları içerirsaç Paketin anlık kuvvet-deplasman ilişkisi ve Paketin kendiliğinden salınım ölçümü.
Introduction
Memelilerin acousticolateralis organları karmaşık bir mimari sahip ve erişim zor olabilir anatomik bir niş içinde yalan. Örneğin, memeli koklea bir sarmal labirent oluşur ve kalın temporal kemik içinde gömülü. Koklea izolasyonu sık sık içinde yatan duyusal hücrelerin mekanik hasara neden olur ve bu nedenle zor bir görev 1 olduğu kanıtlanmıştır. Sinirbilimciler böylece daha kolay kulak kutsal ayıklanır sistemlerin modellenmesi döndü.
Bu model sistemlerinde biri, Amerikan bullfrog (Rana catesbeiana) ve sakkuluslar, yıllardır işitsel ve vestibüler sistemin işlevi içine genellenebilir fikir vermiştir için vardır. sakkuluslar düşük frekanslı işitme ve sismik hissi hem de duyusal rolleri olan bir karma işlev organıdır. sacculus duyusal hücrelerin kendi saç hücreleri, mekanik enerjiyi dönüştürmek uzman dönüştürücüler vardırBizim işitsel ve vestibüler organları içinde elektrik sinyallerine. Her saç hücresinin apikal yüzeyinde çıkıntı stereocilia denilen genişlemiş mikrovilluslar kademeli bir tutam içeren bir mechanosensitive saç demetidir. Bitişik stereocilia uçları lifli uç bağlantı proteinleri ile birbirine mekanik olarak kapısı iyon kanalları mekanik uyarıcılara 2, 3 yanıt olarak. İşitsel ve vestibüler organlar uyaranlara farklı yanıt da, ortak bir algılama mekanizması paylaşır. Bu ortak nokta bullfrog sacculus çalışmaları sayesinde saç hücre mechanotransduction içine aldığı birçok anlayışlar yatmaktadır. Örneğin, saç hücrenin etkin bir süreç bu organ 4, 5, 6, 7 yaygın olarak incelenmiştir, ve saç demeti, mekanik üretmek için bir enerji tüketen işlemini kullanmaktadıriş. Sadece saç hücreleri aktif çalışma 6 oluşturmak olduğu gösterilmiştir, ancak farklı etken sürecini altında yatan mekanizmalar ve saç hücrenin akort özellikleri organlarının acousticolateralis bullfrog çalışmaları ile tanıtıldı edilmiştir. Amfibi papilla saç hücrenin şerit sinaps 12 aktif saç demeti motilite 8 ve saç hücresi elektrik rezonans 9, 10, sacculus 11 ve frekans seçiciliği bulunmaktadır.
Bullfrog en sakkuluslar çeşitli nedenlerle duyusal sinirbilimciler hitap ediyor. Memeli koklea aksine, bu organın kolayca erişilebilir otik kapsül içinde yatıyor. İkincisi, bu organın içindeki saç hücreleri, 14 uygun koşullar 13 altında birkaç saat sağlıklı kalabilir. Bu experimentat izinonların memeli meslektaşları göre uzun zaman ölçekleri üzerinde bu hücrelerin iyon. Üçüncü olarak, organ kolay manipülasyon izin, küçük eğrilik taşır. Dördüncü, her organ, yüksek verimlilik ve belirli bir deney için saç hücrelerinin uygun bir dizi bulma olasılığı yüksek hem de sağlayarak, bin ya da daha fazla saç hücrelerinin 15 içermektedir. Son olarak, Bullfrog en sakkuluslar kolayca nedeniyle saç hücrelerinin bu organ ve büyük boy inceliği ile görüntülenmiştir.
Bu özellikler Bullfrog en sacculus içinde duyu hücrelerinin çalışma için büyük bir çok yönlülük sağlar. eldeki soruya bağlı olarak, bir çok deneysel preparatlarının bir sacculus elde edilebilir. Bu en basit bir bölme hazırlığı olduğunu. Burada sacculus yapay perilenf bir sodyum-zengin ve yüksek kalsiyum tuzlu su ile doldurulmuş bir odacığm içine tesbit edilir. Bu hazırlık saç hücre akımları ve temel saç demeti mekaniği çalışma sağlar. Ikinci bir konfigürasyon, iki odacıklı preparat, kendiliğinden saç demeti hareketleri incelemek için kullanılabilir. bazolateral tarafı yapay perilenf yıkandığı ise burada saç hücrelerinin apikal tarafı potasyum bakımından zengin ve kalsiyum bakımından fakir tuzlu maruz kaldığı, yapay endolymph olarak adlandırılan. Bu iki bölme salines in vivo düzenleme taklit ve saç demetleri kendiliğinden salınım sağlayan bir ortam sağlar.
Bu yazıda duyusal saç hücrelerinin biyofiziksel çalışma için BULLFROG en sacculus hazırlanmasını tarif etmektedir. Biz ilk Kurbağanın iç kulak bu organın izole ayrıntılı bir tasvirini sunar. Daha sonra tek ve iki odacıklı hem deneysel hazırlıkları tanımlamak ve her yapılandırma için temsili sonuçlar içermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bullfrog en sacculus içinde birkaç bin kolayca erişilebilir duyusal saç hücrelerinin yalan. Burada tek ve iki odacıklı kayıtları için çıkarma ve sacculus hazırlanmasını göstermektedir. Bu iki hazırlıkları saç hücreleri ve bunların ilişkili demetleri hem mikromekanik ve elektrofizyolojik çalışmalar izin verir. Doku oksijenli tuz sık değiştirilmesi ile birkaç saat yaşayabilir olduğundan, deneyler uzun süreler için devam edebilir. saç demetleri Ekstraksiyon sonra 24 saat süreyle kendiliğinden salınım yaparken bu hazırlıkların içinde saç hücreleri genellikle, diseksiyon sonra 6 saat süreyle mikroelektrot kayıt için geçerli kalır.
sacculus Başarılı çıkarma ve montaj birkaç ortak zorlukları aşıp dayandırılmıştır. İlk olarak, sakküler makula apikal yüzeyi ile doğrudan temas hazırlık prosedürü boyunca kaçınılmalıdır. sakküler sinir güvenli manipu için uygun bir tanıtıcı sağlarsacculus bir yon. iç kulak organlarının geri kalan kurtulmuş sonra sakkuluslar sıvısında dalmış kalan onun duyusal epiteli mekanik zarar görmesini önlemek için ise bir büyük kalibreli pipet kullanarak transfer edilmelidir. maküler yüzeyinden otokonin çıkarılması saç hücreleri mekanik zarar vermeden tamamlanmalıdır. otokonin makula üstünde doğrudan yalan, çünkü saç hücreleri diseksiyon araçları ve otokonin sökerken otolithic membranı arasındaki kazara temas ile hasar görebilir. zarar görmemesi için, biz otokonin jelatinimsi kütle makula uzak bir yerde tutulan ve tek bir kütle olarak kaldırılmasını öneriyoruz. Bu bireysel çıkarılan olacağını her biri çok sayıda kümeler içine otoconial kütlenin parçalanmasını önler. otokonin küçük kümeler kalırsa onlar Pasteur pipeti tarafından teslim hafif sıvı basıncı ile kaldırılabilir. Son bir meydan okuma olarak sakkuluslar ve alüminyum montaj Meydanı arasında sıkı bir mühür oluşumuyla ilgilidirİki odacıklı preparat. yaklaşık 100 mikron sacculus ve çevresindeki alüminyum izinlerinin doku tam sızdırmazlık arasındaki örtüşme izin vermek için yeterince küçük bir perforasyon bir kare çalışanı. Tutkal sıkı bir mühür oluşturmak üzere, yaklaşık 100 um, maküler en çevresinde sakküler doku ile temas haline getirilmesi gerekmektedir.
Serbest Ca konsantrasyonu 2+ saç hücrelerinin çalışmasında önemli bir husustur. Ca 2 + böylece kendiliğinden paket hareketi 8, 23 de dahil olmak üzere mechanotransduction aygıtının kinetik ve saç demeti aktif işlem olayların özelliklerini belirleyen, hızlı ve yavaş hem de adaptasyon düzenler. In vivo Endolenfatik kalsiyum nedenle çoğu fizyolojik ilgili kinetik bu konsantrasyonda (Maunsell JHR, R. Jacobs ve AJ Hudspeth değerlendirilir, 250 uM'de mevcuttur. Unpublished gözlemler 16). Ancak, saç hücrelerinden mikroelektrot kayıtları mikroelektrot etrafında hücre zarının uygun sızdırmazlık için 2 mM aşan bir dış kalsiyum konsantrasyonunu gerektirir. Deneyler için, yüksek kalsiyum tuz kullanmak zorunludur. Son olarak, bir kalsiyum konsantrasyonları kullanarak çeşitli mechanotransduction üzerine harici kalsiyum etkilerini incelemek isteyebilirsiniz. Bu durumlarda, genellikle uç bağlantı rüptürü ve transdüksiyon 28 geri dönüşümsüz kaybına yol 1 uM'nin altında kalsiyum konsantrasyonlarını hatırlamak önemlidir.
Burada tarif edilen iki deney preparatlar kılı hücrelerinde biyofiziksel ölçümlerin bir dizi sağlar. Bununla birlikte, ilave ölçümler bu preparatların küçük değişiklikler yapılabilir. Katlanmış sakküler hazırlanmasında, saç demetleri yanal görüntülenmiştir. Bu noktadan görüntüleme saç demeti hareket tutarlı mot ortayaHem kısa hem de uzun boylu stereocilia 29 iyon. Burada sakküler makula ilk olarak alttaki dokuya ayrılır ve daha sonra, saç demetleri dışarı doğru bakar ve kırışık yanal görselleştirildiği şekilde sakküler sinir tarafından tanımlanan bir eksen boyunca katlanır. İkinci değişiklik, saç hücre ayrışma, saç hücrenin paket ve soma hem çalışma sağlar. Saç hücreleri mekanik görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıt 30 bir cam slayt üzerine ayrışmış bulunmaktadır. Son olarak, saç hücreleri de benzer bir ayrıştırma protokolü izlenerek, ancak, mekanik ayrıştırma aşaması olmadan epitel ekstrüde edilebilir. mekanik hasar en aza indirirken yavaş yavaş elektrofizyolojik kayıtlar için bazolateral erişim sağlayan, epitel dışarı a'ya saç hücreleri Bu tedavi sonuçları. Bu preparatlar, ve pek çok değişiklik biyofiziksel için bir model sistem olarak kurbağa sacculus çok yönlülüğü göstermektedirduyusal saç hücrelerinin çalışma.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge Dr. A. J. Hudspeth for funding and expertise in developing the preparations described in this paper. We also wish to thank Brian Fabella for creating and maintaining much of the custom equipment and software used in this protocol.
J. B. A. is supported by grant F30DC014215, J. D. S. is supported by grant F30DC013468, and both J. B. A. and J. D. S. are supported by grant T32GM07739 from the National Institutes of Health.
Materials
| Common to both preparations | |||
| Stereo-dissection microscope | Leica | MZ6 | Other sources can be used |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma | E10521 | Other sources can be used |
| Metal pithing rod | Fine Science Tools | 10140-01 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Glass Pasteur pipette and bulb (x2) | Fisher Scientific | 22-042816 | |
| Fine eyelash mounted on a hypodermic needle | Fisher Scientific | 22-557-172 | |
| Dow-corning vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | |
| Syringe for vacuum grease | Fisher Scientific | 14-829-45 | Other sources can be used |
| 35 mm Petri dish (x2-3) | Fisher Scientific | 08-772A | Other sources can be used |
| Micropipette puller | Sutter | P-97 or P-2000 | |
| 120 V Solenoid puller | Home-made, see parts list | ||
| Sputter coater | Anatech USA | Hummer 6.2 | |
| Current source for iontophoresis | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Other sources can be used |
| Piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | P-150-00 | |
| Amplifier for piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | ENV800 | |
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B120F-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For one-chamber preparation | |||
| Microelectrode amplifier | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously |
| Magnetic pins (x2) | Home-made, see parts list | ||
| Open-top chamber with magnetic sheet | Home-made, see parts list | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For two-chamber preparation | |||
| Upper chamber | Supplementary file 1 | ||
| Troughed lower chamber | Supplementary file 2 | ||
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Other sources can be used |
| Mounting block | Supplementary file 3 | ||
| Wooden applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | Other sources can be used |
| Teflon sheet | McMaster-Carr | 8545K12 | For teflon applicator |
| Cyanoacrylate glue | 3M | 1469SB | |
| Lab tissues (Kimwipes) | Fisher Scientific | 06-666A | Other sources can be used |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Other sources can be used |
| Quick-setting epoxy | McMaster-Carr | 7605A18 | |
| 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-546 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline components | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Other sources can be used |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | Other sources can be used |
| CaCl2 • 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Other sources can be used |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | Other sources can be used |
| D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Parts lists for home-made equipment | |||
| Solenoid puller | |||
| Solenoid | Guardian Electric | A420-065426-00 | Other sources can be used |
| Foot-pedal switch | Linemaster | T-51-SC36 | Other sources can be used |
| Pipette holder | World Precision Instruments | MEH900R | Other sources can be used |
| Coarse manipulator | Narishige Group | MM-3 | Other sources can be used |
| Platinum wire | Alfa Aesar | 25093 | Other sources can be used |
| Power supply | Leica | Z050-261 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Magnetic pins | |||
| Epoxy | McMaster-Carr | 7556A33 | Other sources can be used |
| 1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-40 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Open-top magnetic chamber | |||
| Flexible magnetic strip | McMaster-Carr | 5759K75 | Other sources can be used |
| 1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
Riferimenti
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3734-e3734 (2012).
- Howard, J., Hudspeth, A. J. Compliance of the hair bundle associated with gating of mechanoelectrical transduction channels in the bullfrog’s saccular hair cell. Neuron. 1 (3), 189-199 (1988).
- Jaramillo, F., Hudspeth, A. J. Localization of the hair cell’s transduction channels at the hair bundle’s top by iontophoretic application of a channel blocker. Neuron. 7 (3), 409-420 (1991).
- Assad, J. A., Hacohen, N., Corey, D. P. Voltage dependence of adaptation and active bundle movement in bullfrog saccular hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (8), 2918-2922 (1989).
- Benser, M. E., Issa, N. P., Hudspeth, A. J. Hair-bundle stiffness dominates the elastic reactance to otolithic-membrane shear. Hearing research. 68 (2), 243-252 (1993).
- Martin, P., Hudspeth, A. J. Active hair-bundle movements can amplify a hair cell’s response to oscillatory mechanical stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (25), 14306-14311 (1999).
- Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Fabella, B. A., Tobin, M., Hudspeth, A. J. Control of a hair bundle’s mechanosensory function by its mechanical load. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (9), E1000-E1009 (2015).
- Martin, P., Bozovic, D., Choe, Y., Hudspeth, A. J. Spontaneous Oscillation by Hair Bundles of the Bullfrog’s Sacculus. Journal of Neuroscience. 23 (11), 4533-4548 (2003).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. The Journal of physiology. 400, 275-297 (1988).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage-and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. The Journal of physiology. , (1988).
- Fisher, J. A. N., Kowalik, L., Hudspeth, A. J. Imaging electrical resonance in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1651-1656 (2011).
- Patel, S. H., Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Hudspeth, A. J. Frequency-selective exocytosis by ribbon synapses of hair cells in the bullfrog’s amphibian papilla. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (39), 13433-13438 (2012).
- Gale, J. E., Meyers, J. R., Periasamy, A., Corwin, J. T. Survival of bundleless hair cells and subsequent bundle replacement in the bullfrog’s saccule. Journal of neurobiology. 50 (2), 81-92 (2002).
- Hudspeth, A. J. Mechanoelectrical transduction by hair cells of the bullfrog’s sacculus. Progress in brain research. 80, 129-135 (1989).
- Hudspeth, A. J. Integrating the active process of hair cells with cochlear function. Nature Reviews Neuroscience. 15 (9), 600-614 (2014).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Response latency of vertebrate hair cells. Biophysical journal. 26 (3), 499-506 (1979).
- Cheung, E. L. M., Corey, D. P. Ca2+Changes the Force Sensitivity of the Hair-Cell Transduction Channel. Biophysical journal. 90 (1), 124-139 (2006).
- Choe, Y., Magnasco, M. O., Hudspeth, A. J. A model for amplification of hair-bundle motion by cyclical binding of Ca2+ to mechanoelectrical-transduction channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15321-15326 (1998).
- Assad, J. A., Corey, D. P. An active motor model for adaptation by vertebrate hair cells. Journal of Neuroscience. 12 (9), 3291-3309 (1992).
- Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. Activation and adaptation of transducer currents in turtle hair cells. The Journal of physiology. , 405-434 (1989).
- Howard, J., Hudspeth, A. J. Mechanical relaxation of the hair bundle mediates adaptation in mechanoelectrical transduction by the bullfrog’s saccular hair cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (9), 3064-3068 (1987).
- Purves, R. D. The release of drugs from iontophoretic pipettes. Journal of Theoretical Biology. 66 (4), 789-798 (1977).
- Tinevez, J. Y., Jülicher, F., Martin, P. Unifying the various incarnations of active hair-bundle motility by the vertebrate hair cell. Biophysical journal. 93 (11), 4053-4067 (2007).
- Ó Maoiléidigh, D., Nicola, E. M., Hudspeth, A. J. The diverse effects of mechanical loading on active hair bundles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (6), 1943-1948 (2012).
- Kennedy, H. J., Crawford, A. C., Fettiplace, R. Force generation by mammalian hair bundles supports a role in cochlear amplification. Nature. 433 (7028), 880-883 (2005).
- van Netten, S. M., Khanna, S. M. Stiffness changes of the cupula associated with the mechanics of hair cells in the fish lateral line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1549-1553 (1994).
- Bormuth, V., Barral, J., Joanny, J. F., Jülicher, F., Martin, P. Transduction channels’ gating can control friction on vibrating hair-cell bundles in the ear. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7185-7190 (2014).
- Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. The actions of calcium on the mechano-electrical transducer current of turtle hair cells. The Journal of physiology. , 369-398 (1991).
- Kozlov, A. S., Risler, T., Hudspeth, A. J. Coherent motion of stereocilia assures the concerted gating of hair-cell transduction channels. Nature Neuroscience. 10 (1), 87-92 (2007).
- Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Regulation of free Ca2+ concentration in hair-cell stereocilia. Journal of Neuroscience. 18 (16), 6300-6318 (1998).
