هنا، نحن تصف طريقة لعزل الخلايا في البنكرياس المكروية من الجنينية والأنسجة الماوس حديثي الولادة والكبار، مع التركيز على عزل خلايا اللحمة المتوسطة. وتسمح هذه الطريقة التنميط التعبير الجيني الخلايا وإفراز البروتين من أجل توضيح الإشارات التي تنظم خارجي تطوير البنكرياس، وظيفة، وتكون الأورام.
The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.
توازن الطاقة وهضم الطعام في الثدييات يعتمد على وظيفة البنكرياس السليم. ويتكون البنكرياس الكبار من اثنين من مقصورات الخلوية رئيسية: الإفرازية والغدد الصماء. الخلايا الإفرازية، بما في ذلك خلايا عنيبية التي تنتج وتفرز إنزيمات الجهاز الهضمي، والخلايا القناة التي تنقل هذه الانزيمات لللامعاء، وتشمل أكثر من 80٪ من مجموع كتلة البنكرياس 1. خلايا الغدد الصماء، والتي تشمل خلايا بيتا المنتجة للانسولين وخلايا ألفا لإنتاج الجلوكاجون، وتنظم في جزر لانجرهانز التي هي جزء لا يتجزأ في أنسجة خارجية الإفراز وتفرز الهرمونات لتنظيم مستويات الجلوكوز في الدم 2.
خلايا البنكرياس تكتسب مصيرهم متباينة من خلال درجة عالية من التنظيم، عملية متعددة الخطوات 3. الدلائل تشير إلى أن العظة خارجي المقدمة من الخلايا العصبية، الخلايا البطانية، وخلايا اللحمة المتوسطة توجيه تمايز الخلايا في البنكرياس وانتشار في تيكان الجنين 3، 4، 5. ومن الأمثلة على ذلك الشرط من الشريان الأورطي للمواصفات السلائف البنكرياس في وقت مبكر (6). في وقت لاحق في التنمية، عرضت الخلايا البطانية للعب دور محوري في التنمية في كل من خلايا الغدد الصماء وإفرازات البنكرياس وتعزيز بيتا تمايز الخلايا 4، 6، 7. عرضت خلايا اللحمة المتوسطة لدعم بقاء وتوسع من الأسلاف البنكرياس المشتركة، وذلك أساسا من خلال إفراز عامل النمو Fgf10 8 و 9. لقد أظهرنا أيضا أن هذه الخلايا تدعم انتشار الغدد الصماء وخارجية الإفراز السلائف، وكذلك من خلايا متمايزة (بما في ذلك خلايا عنيبية وبيتا) في البنكرياس الجنينية 5. في الآونة الأخيرة، كانت الخلايا الوسيطة مزيدأظهرت لتنظيم خلايا الغدد الصماء التمايز 10.
في البالغين، وعرضت وظيفة خلايا بيتا والكتلة تعتمد على الخلايا في المكروية، بما في ذلك الخلايا العصبية، المناعة، والخلايا البطانية، وكذلك pericytes 11 و 12 و 13. أثناء الإصابة، عرضت الخلايا البطانية لتجنيد الخلايا المناعية إلى البنكرياس لتشجيع تكرار خلايا بيتا 13. عرضت الخلايا البطانية أيضا على إنتاج مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) لدعم التعبير الانسولين وخلايا بيتا وظيفة 14. نحن في الآونة الأخيرة أظهرت شرط pericytes خلايا البنكرياس من أجل وظيفة خلايا بيتا 11. وأخيرا، عرضت خلايا البنكرياس سدى لتنظيم تطور غدية الأقنية البنكرياس (PDAC) 15، 16. ومع ذلك، فإن معرفكيان العظة خارجي أن توجيه التنمية البنكرياس، وظيفة، وتكون الأورام غير معروفة إلى حد كبير.
تحديد العظة التي تقدمها خلايا البنكرياس المكروية يتطلب تميز الجينات والبروتينات التي عبرت عنها هذه الخلايا. هذا يعتمد على عزل هذه الخلايا من البنكرياس من أجل أداء والتعبير الجيني والتحليلات البروتين و / أو على إنشاء خطوط الخلايا. هنا، نقترح طريقة لعزل خلايا اللحمة المتوسطة من المكروية البنكرياس عن طريق استخدام أنسجة الأنزيمية الهضم ومضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) اما من الخلايا المسمى immunofluorescently أو الخلايا معربا عن البروتينات الفلورية. تم تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح لعزل وتحليل البروتين الفلوري أصفر (YFP) -expressing خلايا اللحمة المتوسطة من الجنينية، حديثي الولادة، والكبار البنكرياس 5، 17.
هنا، نحن تصف طريقة لعزل وتحليل خلايا البنكرياس المكروية. وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لعزل خلايا اللحمة المتوسطة من الأنسجة الجنينية البنكرياس والكبار. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمنا بنجاح هذا البروتوكول لعزل الخلايا البطانية من البالغين والأطفال حديثي الولادة البنكرياس 5، 17. ومع ذلك، قد لا تكون مناسبة للحصول على تعليق وحيد الخلية استنساخه من خلايا الظهارية البنكرياس (موصوفة بروتوكولات بديلة في المراجع 18 و 23 و 24). باستخدام هذه الطريقة، وخلايا fluorescently المسمى، إما التعبير عن البروتينات الفلورية أو immunostained عن علامات سطح، يمكن تنقيته بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية أو تحليلها من قبل التدفق الخلوي. RNA يمكن استخراجها من خلايا النقاء لمحة نمط التعبير الجيني بهم. بدلا من ذلك، فإن الخلايا تنقيته يمكن تربيتها لإنشاء خط خلية للتحليل البروتين لاحق. وهذه الطريقة يمكن توصيف العوامل هxpressed من قبل المكروية البنكرياس، التي تحكم بها توالد، علم وظائف الأعضاء، والفيزيولوجيا المرضية.
اللحمة المتوسطة البنكرياس تدعم توالد الأنسجة عن طريق تعزيز انتشار السلائف وخلايا متباينة 5، 9. وقد أظهرت هذه الخلايا لدعم التوسع في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) -derived الأسلاف البنكرياس 17 و 25 و 26. لذلك، ترسيم الهوية من العوامل الوسيطة الجنينية من شأنها تسهيل الجهود المبذولة حاليا لتوليد خلايا بيتا المنتجة للأنسولين من hESCs والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) كعلاج محتمل لمرض السكري. سمحت الدراسات الجينية الماوس تحديد عوامل النمو، مثل Fgf10، التي يتم إنتاجها من قبل اللحمة المتوسطة لتعزيز التوسع ظهارة البنكرياس خلال المراحل الأولى من تطوير البنكرياس3 و 9. بهدف تحديد العوامل الإضافية التي أعرب عنها في اللحمة المتوسطة الجنينية، ونحن عزل هذه الخلايا باستخدام تسليخ مجهري-القبض على الليزر، واستخراج الحمض النووي الريبي، وويقوم الجين تحليل التعبير 26. ومع ذلك، بالإضافة إلى كونها عمالة مكثفة، ويعتمد هذا الأسلوب على تحديد الخلايا استنادا خصائصها المورفولوجية، الذي حصر استخدامه في مراحل النمو قبل المتفرعة من الظهارة في اللحمة المتوسطة المحيطة بها (أي E12.5). لتوصيف خلايا اللحمة المتوسطة في مراحل النمو اللاحقة، قمنا باستخدام الطريقة الموصوفة هنا 5، 17.
استخدمنا هذه الطريقة لتحليل التعبير سطح علامة من الأطفال حديثي الولادة اللحمة المتوسطة البنكرياس 5. وبالإضافة إلى ذلك، تم عزل خلايا اللحمة المتوسطة من الأنسجة الجنينية البنكرياس والأطفال حديثي الولادة من Nkx3.2 -Cre، الفئران R26-EYFP، استنادا إلىوضع العلامات الفلورية في هذا الخط الماوس، وكان مثقف لإنشاء خطوط الخلايا 17. تحليل البروتين من هذه الخلايا يسمح لتحديد العوامل التي يفرزها البنكرياس اللحمة المتوسطة مع القدرة على تعزيز الأسلاف البنكرياس المستمدة HESC 17. كنا مزيد من هذه الخلية طريقة العزل لتنقية خلايا اللحمة المتوسطة من أنسجة البنكرياس الكبار لاستخراج الحمض النووي الريبي والتعبير الجيني تحليل 17. ولذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحديد الجينات والبروتينات التي أعرب عنها اللحمة المتوسطة البنكرياس، مع القدرة على دعم التنمية خلية البنكرياس.
عرضت خلايا البنكرياس الوسيطة أيضا أن تلعب دورا في تكون الأورام البنكرياس. يتميز PDAC قبل تشكيل سدى صلدة-الليفية الغنية تتألف من الخلايا الليفية، الخلايا المناعية، وECM 27. في حين كان يعتقد سدى لتعزيز التنمية في كثير منأنواع من السرطان، وقد تبين أنه لكبح جماح PDAC تقدم 15 و 16 و 28. هذا يشير إلى أن مكونات سدى البنكرياس تفرز العوامل التي تحول دون تكون الأورام. وعلاوة على ذلك، يمكن للتغيرات في سدى تكوين الخلايا وكذلك في النمط الظاهري الخلايا تكمن وراء تأثيرها على الخلايا الظهارية 15 و 16 و 28. وبالتالي يمكن أن الطريقة الموصوفة هنا تساعد في وصف أنواع مختلفة من الخلايا التي تشكل سدى PDAC بالمقارنة مع أنسجة البنكرياس صحية. فإنه كذلك السماح لتنقية مختلف أنواع الخلايا اللحمية لوصف التغيرات المحتملة في ملفاتهم الشخصية التعبير الجيني أثناء تطور PDAC. ولكن نظرا للتغيرات في تكوين ECM البنكرياس أثناء تكون الأورام 27، والتعديلات المعلمات الهضم الأنسجة، مثل إدراج المضافاتIONAL أنواع كولاجيناز أو زيادة فترة حضانة، قد يكون مطلوبا.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.
Collagenase P | Roche | 11213865001 | |
DNase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | The effective units should be at least 2000 unitz/ml protein |
Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H6648 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
EDTA | Biological Industries | 01-862-1A | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Goat IgG serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
RNAse inhibitor | Invitrogen | N8080119 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965092 | |
L-Glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
Penicillin-streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride |
1.5 ml tubes | Sarstedt | 72 690 | |
15 ml conical tube | Corning | 430052 | |
Round Bottom Polystyrene 5 ml tube | Corning | 352008 | FACS tube'. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands |
5ml tube with 35 μm cell strainer Snap Cap | Corning | 352235 | FACS tube' |
70 μm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
Heating block with agitation | Eppendorf | ThermoMixer C | |
Centrifuge | ThermoFisher | Heraeus Megafuge 40R | |
Steromicroscope | Nikon | SMZ 745 | |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria IIu | |
flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios |