분리 및 유동 세포 계측법에 의해 췌장 중간 엽 세포 분석
Summary
여기서, 우리는 중간 엽 세포의 분리에 초점 배아 신생아 및 성인 마우스 조직에서 췌장 미세 세포의 분리 방법을 설명한다. 이 방법은 췌장 개발, 기능 및 종양 형성을 조절하는 외부 신호를 명료하게하기 위하여 세포 유전자 발현 및 단백질 분비를 프로파일 링 할 수있다.
Abstract
The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.
Introduction
에너지 항상성과 포유 동물에서 음식을 소화 적절한 췌장 기능에 따라 달라집니다. 외분비 및 내분비 : 성인 췌장은 두 가지 세포 구획으로 구성되어 있습니다. 생산 및 분비하는 소화 효소 및 소화관에 이들 효소를 운반 덕트 세포를 췌장의 총 질량 (1)의 80 % 이상을 포함 선포 세포를 포함 외분비 세포. 인슐린 – 생산 베타 세포의 제조 및 글루카곤 알파 세포를 포함하는 내분비 세포는 외분비 조직에 삽입 및 혈당이 조절 호르몬을 분비된다 랑게르한스섬이 구성된다.
췌장 세포가 고도로 규제, 다단계 과정 3을 통해 차별화 된 운명을 획득. 증거는 신경 세포, 내피 세포 및 중간 엽 세포에 의해 제공 외적 단서가 t의 췌장 세포 분화 및 증식을 유도 제안그 배아 3, 4, 5. 일 예는 이른 췌장 전구체 (6)의 사양 대동맥의 요구 사항이다. 나중에 개발, 내피 세포는 모두 췌장 내분비와 외분비 세포의 발달에서 중요한 역할을하는 베타 세포 분화 4, 6, 7을 촉진하기 위해 도시 하였다. 간엽 세포는 주로 성장 인자 Fgf10 (8, 9)의 분비를 통해 생존과 공통 췌장 전구 세포의 확장을 지원하기 위해 도시 하였다. 우리는 또한이 세포는 배아 췌장 5 내분비와 외분비 전구체의 증식뿐 아니라의 (소엽 및 베타 세포 포함)에 분화 세포를 지원하는 것을 보여준다. 최근, 중간 엽 세포는 더 있었다내분비 세포 분화 (10)를 규제하는 도시.
성인에있어서, 베타 세포 기능 및 질량 면역 신경 세포, 내피 세포,뿐만 아니라 혈관 주위 세포 11,12,13 포함한 미세 세포에 의존하는 것으로 나타났다. 부상하는 동안, 내피 세포는 베타 세포 복제 (13)을 촉진하기 위해 췌장에 면역 세포를 모집 것으로 나타났다. 내피 세포는 또한 인슐린 발현과 베타 세포 기능 (14)을지지하는 세포 외 기질 (ECM) 성분을 생성하기 위해 도시 하였다. 우리는 최근 베타 세포 기능 11 섬 혈관 주위 세포의 요구 사항을 보여 주었다. 마지막으로, 췌장 실질 세포는 췌장 선암 도관 (PDAC) (15, 16)의 진행을 조절하는 것으로 나타났다. 그러나, 아이디췌장 개발, 기능 및 종양 안내 외인성 큐 엔티티는 대부분 알려져 있지 않다.
췌장 미세 세포에 의해 제공되는 신호를 식별하는 것은 이들 세포에서 발현되는 유전자와 단백질의 특성을 필요로한다. 이러한 및 / 또는 세포주를 확립에서 유전자 발현 및 단백질 체학 분석을 수행하기 위해, 췌장에서 이들 세포를 분리에 달려있다. 여기서는 형광 단백질을 발현 immunofluorescently 표지 된 세포 또는 세포 중의 정렬 조직 효소 분해 형광 – 활성화 된 세포 (FACS)를 사용하여 췌장 미세의 중간 엽 세포를 분리하는 방법을 제안한다. 이 프로토콜은 성공적 배아 신생아 및 성인 췌장 (5), (17)의 중간 엽 세포를 분리 및 옐로우 형광 단백질 (YFP) 발현을 분석 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서는 분리하고 췌장 세포의 미세 환경을 분석하는 방법을 설명한다. 이 방법은 배아 및 성체 췌장 조직으로부터 간엽 세포를 분리하는데 사용될 수있다. 또한, 성공적 성인 및 신생아 췌장 5 (17)으로부터 내피 세포를 분리하기 위해 프로토콜을 사용 하였다. 그러나, (다른 프로토콜 (24)을 참조하는 (18), 23에 설명되어) 췌장 상피 세포의 재생 가능한 단일 세포 현탁액을 수득하기에 적합하지 않을 수있다. 이 방법에있어서, 형광 표지 된 세포를 사용하여, 어느 형광 단백질을 발현 또는 표면 마커에 대한 면역 염색, FACS 그래피 또는 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 수있다. RNA는 유전자 발현 패턴 프로파일 정제 된 세포로부터 추출 될 수있다. 대안 적으로, 정제 된 세포는 후속 프로테옴 분석 세포주를 확립 배양 할 수있다. 이 방법은 요소 (E)의 특성화를 가능하게그 기관 형성, 생리학 및 병태 생리를 지배하는 췌장의 미세 환경에 의해 xpressed.
췌장 중간 엽는 전구체 및 분화 세포 5, 9의 증식을 촉진하여 조직의 기관 형성을 지원합니다. 이러한 세포는 인간 배아 줄기 세포의 확장을 지원하는 것으로 나타났다 (hESC의)는 췌장 전구 세포를 17, 25, 26 – 유래. 따라서, 배아 중배엽 요소의 ID를 서술하면 hESCs는 당뇨병에 대한 잠재적 치료제로서 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 인슐린 – 생산 베타 세포를 생성하기 위해 현재의 활동을 촉진한다. 마우스 유전자 연구는 췌장 개발의 초기 단계에서 췌장 상피 확장을 촉진하는 간엽에 의해 생성되는 이러한 Fgf10 같은 성장 인자의 식별을 허용3 구. 배아 간엽 표현 추가 요소를 식별하기위한 목적으로, 우리는 레이저 캡처 미세 절제를 사용하여 이러한 세포를 격리 그들의 RNA를 추출하고, 유전자 발현 분석 (26)을 수행 하였다. 그러나, 노동 집약적 인 것에 더하여,이 방법은 종래 주변 간엽 (즉, E12.5)에 상피의 분지에 발달 단계에 사용을 제한하고 그 형태 적 특징에 기초하여 셀 식별에 의존한다. 나중 개발 단계에서 중간 엽 세포를 특성화하기 위해, 우리는 여기서 5, 17에 기재된 방법을 채용.
우리는 신생아 췌장 중간 엽 (5)에 의해 표면 마커의 발현을 분석하기 위해이 방법을 사용했다. 또한, 중간 엽 세포 Nkx3.2 -Cre의 태아 및 신생아의 췌장 조직에서 분리 하였다 R26-EYFP 쥐에 기초그 형광이 마우스 라인 라벨링 및 세포주 (17)을 설정할 배양 하였다. hESC의 유래의 췌장 전구 세포 (17)을 촉진하는 기능 간엽 췌장 분비 인자의 동정 허용 이들 세포의 프로테옴 분석. 우리는 또한 RNA 추출 및 유전자 발현 해석 17 성인 췌장 조직으로부터 간엽 세포를 정제하기 위해 세포 분리 방법을 사용 하였다. 따라서,이 방법은 췌장 세포의 개발을 지원하는 능력, 췌장 간엽 의해 발현 유전자와 단백질을 식별하기 위해 사용될 수있다.
췌장 중배엽 세포는 또한 췌장 종양 발생에 중요한 역할을하는 것으로 하였다. PDAC은 섬유 아세포, 면역 세포로 이루어진 섬유 아세포 풍부한 기질 결합 조직의 형성과 ECM (27)을 특징으로한다. 기질은 많은 발전을 촉진하는 것으로 생각 동안암 유형은 그것의 진행 PDAC (15, 16), (28)을 억제하는 것으로 하였다. 이는 췌장 기질의 구성 요소가 종양을 억제 인자를 분비하는 것이 좋습니다. 또한, 간질 세포 조성물뿐만 아니라, 세포의 표현형의 변화는 상피 세포 (15, 16), (28)에 미치는 영향을 기초 할 수있다. 여기에 기재된 방법에 따라서, 건강한 췌장 조직에 비해 PDAC 기질을 구성하는 다양한 세포 유형 특성화 지원할 수있다. 그것은 또한 다른 간질 세포 유형의 정제 PDAC 진행 중에 그 유전자 발현 프로파일의 전위의 변화를 특성화하도록 허용한다. 그러나, 종양 27 일 동안 췌장 ECM 조성의 변화 등을 포함 되어온 같은 조직 소화 파라미터 조정콜라게나하는 ional 종류 또는 배양 시간을 증가 요구 될 수있다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.
Materials
| Collagenase P | Roche | 11213865001 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | The effective units should be at least 2000 unitz/ml protein |
| Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| EDTA | Biological Industries | 01-862-1A | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Goat IgG serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNAse inhibitor | Invitrogen | N8080119 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965092 | |
| L-Glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride |
| 1.5 ml tubes | Sarstedt | 72 690 | |
| 15 ml conical tube | Corning | 430052 | |
| Round Bottom Polystyrene 5 ml tube | Corning | 352008 | FACS tube'. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands |
| 5ml tube with 35 μm cell strainer Snap Cap | Corning | 352235 | FACS tube' |
| 70 μm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| Heating block with agitation | Eppendorf | ThermoMixer C | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Heraeus Megafuge 40R | |
| Steromicroscope | Nikon | SMZ 745 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria IIu | |
| flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios |
Riferimenti
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