Identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo
Summary
Enquanto os macrófagos infiltrativos são continuamente recrutados para tecidos adultos a partir de precursores circulantes, os macrófagos residentes semeiam seu tecido durante o desenvolvimento, onde são mantidos sem mais entrada de progenitores. Os progenitores para macrófagos residentes foram identificados recentemente. Aqui, apresentamos métodos para o mapeamento do destino genético dos progenitores de macrófagos residentes.
Abstract
Os macrófagos são fagócitos profissionais do braço inato do sistema imunológico. Em estado estacionário, os macrófagos sésseis são encontrados em tecidos adultos, onde atuam como sentinelas de linha de frente e danos nos tecidos. Enquanto outras células imunes são continuamente renovadas a partir de células hematopoiéticas e progenitoras (HSPC) localizadas na medula óssea, uma linhagem de macrófagos, conhecida como macrófagos residentes, mostrou-se auto-mantida em tecidos sem a entrada de HSPC de medula óssea. Esta linhagem é exemplificada por microglia no cérebro, células de Kupffer no fígado e células de Langerhans na epiderme entre outros. A lâmina própria do intestino e do cólon são os únicos tecidos adultos desprovidos de macrófagos residentes independentes da HSPC. Pesquisas recentes identificaram que os macrófagos residentes são originários da hematopoiese do saco de gema extra-embrionária do (s) progenitor (es) distinto (s) das células estaminais hematopoiéticas do feto (HSC). Entre a hematopoiese definitiva do saco vitelino, eOs progenitores ritromoeloides (EMP) dão origem a células eritróides e mielóides, em particular macrófagos residentes. EMP só são gerados dentro do saco vitelino entre E8.5 e E10.5 dias de desenvolvimento e eles migram para o fígado fetal logo que a circulação está conectada, onde eles se expandem e diferenciam até pelo menos E16.5. Sua progênie inclui eritrócitos, macrófagos, neutrófilos e mastócitos, mas apenas os macrófagos derivados de EMP persistem até a idade adulta nos tecidos. A natureza transitória do surgimento do EMP e a sobreposição temporal com a geração de HSC tornam difícil a análise desses progenitores. Nós estabelecemos um protocolo de mapeamento de destino induzível por tamoxifeno com base na expressão do promotor Csf1r do receptor de citoquina de macrófagos para caracterizar células derivadas de EMP e EMP in vivo por citometria de fluxo.
Introduction
Existem várias ondas sucessivas mas sobrepostas de progenitores hematopoiéticos durante o desenvolvimento, cuja progenitura mielóide permanece na idade adulta. Em primeiro lugar, os progenitores "primitivos" unipotentes emergem no saco vitelino 1 , 2 entre E7.5-E8.25 e dão origem a macrófagos embrionários sem qualquer intermediário monocítico. Se os macrófagos derivados de progenitores primitivos persistem no cérebro adulto, uma vez que a microglia continua sendo objeto de investigação ativa. Em segundo lugar, os precursores eritemo-mieloides (EMPs) surgem no saco vitelino em E8.5, entram na corrente sanguínea e colonizam o embrião. EMPs emergem do endotélio hemogênico do saco vitelino em uma transição endotelial a hematopoiética dependente de Runx1 3 , 4 . Enquanto a EMP pode se diferenciar em macrófagos dentro do saco vitelino, eles também colonizam o fígado fetal do dia embrionário (E) 9 5 e diferemEm eritrócitos, megacariócitos, macrófagos, granulócitos de monócitos e mastócitos 6 . Os macrófagos que derivam de EMP exibem capacidade proliferativa em tecidos de desenvolvimento e adultos. Se os macrófagos derivados de EMP ignoram o estágio de diferenciação de monócitos ainda são controversos, como muito pouco se sabe sobre sua via de diferenciação 7 , 8 . Finalmente, as células estaminais hematopoiéticas (HSCs) emergem em E10.5 dentro do embrião próprio da região aorta-gonad-mesonephros e migram para o fígado fetal. Os HSCs com capacidade de repovoamento a longo prazo só são detectados após E11 (no estágio de 42 pares de somites) 9 . Lá, eles se expandem e diferenciam de E12.5 até a hematopoiese definitiva começa a se deslocar para a medula óssea, o que se torna o local predominante de produção de células sangüíneas durante a vida pós-natal 10 .
O spA sobreposição temporal e temporal no surgimento, bem como os marcadores imunofotípicos compartilhados, até agora dificultaram a nossa capacidade de distinguir as contribuições específicas dessas ondas de progenitores hematopoiéticos embrionários. Enquanto tanto o EMP quanto o HSC são gerados de forma dependente do Runx1 e expressam o fator de transcrição Myb e o receptor do fator de crescimento Csf1r (Receptor do Factor Estimulante da Colônia 1, também conhecido como Receptor do Fator de Estimulação da Colônia de Macrófagos) entre outros, os EMPs podem ser distinguidos de HSCs pela falta de potencial linfóide, tanto in vitro como in vivo , a falta de potencial de repovoamento a longo prazo e a falta de expressão superficial do marcador de linhagem Sca-1 11 . Os modelos de mapeamento do destino genético são necessários para caracterizar a ontogenia dos macrófagos, uma vez que permitem alvejar progenitores embrionários de uma maneira específica de cada célula e específica do tempo. Aqui apresentamos o protocolo de mapeamento do destino usado em nosso laboratório para discriminar entre os dois linhagensS de macrófagos encontrados na maioria dos tecidos adultos: macrófagos infiltrados derivados de HSC e macrófagos residentes independentes de HSC.
Os macrófagos residentes de tecido foram rastreados de acordo com células precursoras independentes de Myb expressando o receptor de citoquinas Csf1r 12 e estão presentes no embrião em E8.5-E10.5 usando três estratégias complementares de mapeamento de destino 6 . Para estudar a hematopoiese do saco vitelino sem rotulagem de HSC fetal, utilizamos uma cepa transgênica, Csf1r MeriCreMer , expressando uma proteína de fusão induzível por tamoxifeno de Cre recombinase "melhorada" e dois receptores de estrogênio de mouse (Mer-iCre-Mer) sob o controle de O promotor Csf1r. Assim, a Cre recombase estará ativa em células Csf1r -expressing durante uma janela de tempo limitada. Quando usado com uma estirpe repórter contendo uma proteína fluorescente a jusante de uma cassete lox-STOP-lox (Rosa26 LSL-eYFP ), isso levará ao permanenteEtiquetagem genética das células presentes no momento da indução, mas também da sua progênie. A administração em E8.5 da forma ativa de tamoxifeno, 4-hidroxitoxififeno (OH-TAM), rotula EMPs e macrófagos, sem rotulagem de progenitores "primitivos" unipotentes de vira-lata ou HSC fetal. Deste modo, caracterizamos o imunofenotipo de EMPs e sua progênie durante o desenvolvimento embrionário, bem como avaliaram a contribuição dos macrófagos derivados do saco de gema para os grupos de macrófagos adultos. São necessários mais trabalhos para caracterizar se os macrófagos primários progenitoros derivados também são rotulados usando essa abordagem e se eles podem contribuir para grupos de macrófagos adultos.
Protocol
Representative Results
Discussion
As diferentes ondas de células precursoras hematopoiéticas se sobrepõem parcialmente dentro de um curto período de tempo, o que torna a análise da contribuição de cada onda de hematopoiese de desenvolvimento para células imunes tecnicamente muito desafiadora.
Os sistemas Cre induzíveis de tamoxifeno oferecem a oportunidade de marcar células específicas de forma temporariamente indutível e realizar análises de linhagem em embriões ou adultos, sem a necessidade de cultura ou tran…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Prof. Frederic Geissmann e ao Prof. Christian Schulz por discussões perspicazes; Dr. Hannah Garner para a leitura crítica do manuscrito, o Dr. Xavier Montagutelli e o Dr. Jean Jaubert e os funcionários da unidade animal do Instituto Pasteur para apoio à criação de camundongos; E Pascal Dardenne e Vytaute Boreikaite, um Amgen Scholar, por sua assistência técnica. A pesquisa no laboratório EGP é financiada pelo Instituto Pasteur, o CNRS, o Cercle FSER (FRM e um pacote de partida do Institut Pasteur e do consórcio REVIVE. LI é apoiado por uma bolsa de doutorado do consórcio REVIVE.
Materials
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-well tissue culture plate | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 wells U-shape bottom tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Syringe Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Nylon grid 100 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Nylon grid 70 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon tubes | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment |
| Progesterone | Sigma | P3972 | Always use appropriate personal protective equipment |
| PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Sunflower oil | Sigma | S5007-250ML | |
| Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antibody Capture Bead kit (2×5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson laboratory | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson laboratory | 6148 |
Riferimenti
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