Identification des progéniteurs érythromyélidiens et de leur descendance dans l'embryon de souris par cytométrie de flux
Summary
Alors que les macrophages infiltrés sont continuellement recrutés sur les tissus adultes à partir de précurseurs circulants, les macrophages résidents sement leurs tissus pendant le développement, où ils sont maintenus sans autre contribution des progéniteurs. Les ancêtres des macrophages résidents ont récemment été identifiés. Ici, nous présentons des méthodes pour la cartographie du devenir génétique des progéniteurs résidents de macrophages.
Abstract
Les macrophages sont des phagocytes professionnels du bras inné du système immunitaire. À l'état stable, les macrophages sessiles se retrouvent dans les tissus adultes où ils agissent comme des sentinelles de front d'infection et des lésions tissulaires. Alors que d'autres cellules immunitaires sont continuellement renouvelées à partir de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) situées dans la moelle osseuse, une lignée de macrophages, connue sous le nom de macrophages résidents, s'est révélée être auto-entretenue dans les tissus sans apport de HSPC de moelle osseuse. Cette lignée est illustrée par la microglie dans le cerveau, les cellules de Kupffer dans le foie et les cellules de Langerhans dans l'épiderme parmi d'autres. La lamelle intestinale et la lame de côlon sont les seuls tissus adultes dépourvus de macrophages résidents indépendants de HSPC. Des recherches récentes ont révélé que les macrophages résidents proviennent de l'hématopoïèse extra-embryonnaire des sacs vésicaux à partir de progéniteurs distincts des cellules souches hématopoïétiques fœtales (HSC). Chez l'hématopoïèse définitive du sac jaune, eLes progéniteurs rythromyélidiques (EMP) donnent naissance à la fois aux cellules érythroïdes et myéloïdes, en particulier les macrophages résidents. EMP ne sont générés que dans le sac jaune entre E8.5 et E10.5 jours de développement et ils migrent vers le foetus foetal dès que la circulation est connectée, où ils se développent et se différencient jusqu'à au moins E16.5. Leur descendance comprend les érythrocytes, les macrophages, les neutrophiles et les mastocytes, mais seuls les macrophages dérivés de l'EMP persistent jusqu'à l'âge adulte dans les tissus. La nature transitoire de l'émergence de l'EMP et le chevauchement temporel avec la génération HSC rend difficile l'analyse de ces progéniteurs. Nous avons établi un protocole de cartographie du sort inducible au tamoxifène basé sur l'expression du promoteur Csf1r du récepteur des cytokines des macrophages pour caractériser les cellules dérivées de l'EMP et de l'EMP in vivo par cytométrie de flux.
Introduction
Il existe plusieurs vagues de progéniteurs hématopoïétiques successifs mais se chevauchant pendant le développement dont la descendance myéloïde reste à l'âge adulte. Tout d' abord, unipotentes progéniteurs « primitives » apparaissent dans le sac vitellin de la souris 1, 2 entre E7.5-E8.25 et donnent lieu à des macrophages embryonnaires sans intermédiaire monocytaire. Que les macrophages dérivés de progéniteurs primitifs persistent dans le cerveau adulte car la microglie reste un sujet d'investigation active. Deuxièmement, les précurseurs érythro-myéloïdes (EMP) apparaissent dans le sac jaune chez E8.5, entre dans la circulation sanguine et colonisent l'embryon. Les EMP sortent de l'endothélium hémogène du sac vénitien dans une transition endothélial-hématopoïétique dépendant de Runx1 3 , 4 . Alors que EMP peut se différencier en macrophages dans le sac jaune, ils colonisent également le foie foetal du jour embryonnaire (E) 9 5 et différentDans les érythrocytes, les mégacaryocytes, les macrophages, les granocytes monocytes et les mastocytes 6 . Les macrophages qui proviennent des EMP présentent une capacité proliférative dans les tissus de développement et adultes. La question de savoir si les macrophages dérivés de l'EMP contournent le stade de la différenciation des monocytes est encore controversée car on sait très peu de choses sur leur voie de différenciation 7 , 8 . Enfin, les cellules souches hématopoïétiques (HSC) émergent à E10.5 dans l'embryon proprement dite de la région aorte-gonade-mésonephros et migrent vers le foie foetal. Les HSC avec une capacité de repeuplement à long terme ne sont détectés qu'après E11 (au stade de la paire 42 somite) 9 . Là, ils se développent et se différencient de E12.5 jusqu'à ce que l'hématopoïèse définitive commence à se déplacer vers la moelle osseuse, ce qui devient le site prédominant de la production de globules sanguins pendant la durée de la vie postnatal 10 .
Le spLe chevauchement temporel et temporel dans l'émergence, ainsi que les marqueurs immuno-phénotypiques partagés ont jusqu'à présent entravé notre capacité à distinguer les contributions spécifiques de ces ondes de progéniteurs hématopoïétiques embryonnaires. Alors que EMP et HSC sont générés de manière dépendante de Runx1 et expriment le facteur de transcription Myb et le récepteur du facteur de croissance Csf1r (Récepteur Factor 1 de Colony-Stimulating, également connu sous le nom de Récepteur de Facteur Stimulant de colonie de Macrophage) parmi d'autres, les EMP peuvent être distingués de HSC par leur manque de potentiel lymphoïde, in vitro et in vivo , leur manque de potentiel de repopulation à long terme et le manque d'expression superficielle du marqueur de lignée Sca-1 11 . Des modèles de cartographie du sort génétique sont nécessaires pour caractériser l'ontogénie des macrophages, car ils permettent de cibler les progéniteurs embryonnaires de manière spécifique à chaque cellule et à chaque fois. Nous présentons ici le protocole de cartographie du destin utilisé dans notre laboratoire pour discriminer les deux lignéesS des macrophages présents dans la plupart des tissus adultes: les macrophages infiltrés dérivés de HSC et les macrophages résidents indépendants de HSC.
Les macrophages résiduaires de tissus ont été remontés aux cellules précurseurs indépendantes de Myb exprimant le récepteur de cytokine Csf1r 12 et sont présents dans l'embryon à E8.5-E10.5 en utilisant trois stratégies complémentaires de cartographie du sort 6 . Pour étudier l'hématopoïèse des sacs vésicaux sans étiquetage des HSC foetaux, nous utilisons une souche transgénique, Csf1r MeriCreMer , exprimant une protéine de fusion inducible au tamoxifène de Cre recombinase améliorée et deux récepteurs d'œstrogènes de souris (Mer-iCre-Mer) sous le contrôle de Le promoteur Csf1r. Par conséquent, la recombinase Cre sera active dans Csf1r -expressing cells pendant une fenêtre temporelle limitée. Lorsqu'il est utilisé avec une souche rapportrice contenant une protéine fluorescente en aval d'une cassette Lox-STOP-lox (Rosa26 LSL-eYFP ), elle conduira à la permanenceL'étiquetage génétique des cellules présentes au moment de l'induction mais aussi de leur descendance. L'administration à E8.5 de la forme active du tamoxifène, du 4-hydroxytamoxifène (OH-TAM), des EMP et des macrophages, sans étiquetage des progéniteurs "primitifs" ou des HSC foetaux unipotents. Ainsi, nous avons caractérisé l'immunophénotype des EMP et leur descendance pendant le développement embryonnaire, ainsi que la contribution des macrophages dérivés du sac vésiculaire aux pools de macrophages adultes. Un travail supplémentaire est nécessaire pour caractériser si les macrophages dérivés de progéniteurs primitifs sont également étiquetés en utilisant cette approche et s'ils peuvent contribuer à des pools de macrophages adultes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les différentes ondes de cellules précurseurs hématopoïétiques se chevauchent partiellement dans un court laps de temps, ce qui rend l'analyse de la contribution de chaque onde d'hématopoïèse du développement aux cellules immunitaires techniquement très difficile.
Les systèmes créateurs inducibles au tamoxifène offrent l'opportunité de marquer des cellules spécifiques de façon inducible dans le temps et d'effectuer une analyse de lignage chez des embryons ou d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le professeur Frédéric Geissmann et le professeur Christian Schulz pour des discussions approfondies; Dr Hannah Garner pour la lecture critique du manuscrit, le Dr Xavier Montagutelli et le Dr Jean Jaubert et le personnel de l'établissement animalier Institut Pasteur pour le soutien à l'élevage de souris; Et Pascal Dardenne et Vytaute Boreikaite, un Amgen Scholar, pour leur assistance technique. La recherche dans le laboratoire EGP est financée par l'Institut Pasteur, le CNRS, le Cercle FSER (FRM et un paquet de départ de l'Institut Pasteur et le consortium REVIVE. LI est soutenu par une bourse de doctorat du consortium REVIVE.
Materials
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-well tissue culture plate | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 wells U-shape bottom tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Syringe Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Nylon grid 100 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Nylon grid 70 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon tubes | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment |
| Progesterone | Sigma | P3972 | Always use appropriate personal protective equipment |
| PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Sunflower oil | Sigma | S5007-250ML | |
| Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antibody Capture Bead kit (2×5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson laboratory | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson laboratory | 6148 |
Riferimenti
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