Effektiv isolering av funktionella cellöar från nyfödda mus bukspottkörteln
Summary
Vi beskriver ett protokoll häri för att isolera intakta cellöar från neonatala möss. Pankreata rades partiellt med kollagenas, följt av tvättning och handplockning. 20 – 80 ö kluster kan erhållas per bukspottkörtel från nyfödda möss, som lämpar sig för flera ö studier.
Abstract
Perfusion baserad ö-isolering protokoll från stora däggdjur pancreata är väl etablerade. Sådana protokoll kan lätt utföras i många laboratorier på grund av den stora storleken på den pankreatiska gången som möjliggör klar kollagenas injektion och efterföljande vävnadsperfusion. Däremot holme isolering från små pankreata, i likhet med neonatala möss, är en utmaning eftersom perfusion är inte lätt att uppnå i den lilla pancreata. Här beskriver vi en detaljerad enkel procedur som återvinner betydande antal öar från nyfödda möss med visuell hjälp. Färskt dissekerade hela pankreata digererades med 0,5 mg / ml kollagenas IV löst i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) vid 37 ° C, i mikrocentrifugrör. Rören knackade regelbundet för att underlätta vävnads spridning. När det mesta av vävnaden dispergerades till små kluster runt en mm, var lysat tvättades tre till fyra gånger med odlingsmedium med 10% fetalt bovint serum (FBS). Ö kluster,saknar igenkännbara körtelvävnad, kan därefter utvinnas enligt dissekera stereoskop. Denna metod återvinner 20-80 små till stora öar per bukspottkörteln hos nyfödda mus. Dessa öar är lämpliga för de flesta tänkbara nedströms analyser, inklusive insulinutsöndring, genuttryck, och kultur. Ett exempel på insulinsekretion assay presenteras för att validera isoleringsprocessen. Den genetiska bakgrunden och utrötningsgraden är de största faktorer som avgör avkastningen. Nyligen gjorde kollagenas lösning med hög aktivitet är att föredra, eftersom det underlättar hormon exokrin isolering. Närvaron av katjoner [kalcium (Ca2 +) och magnesium (Mg2 +)] i alla lösningar och fetalt bovint serum i tvätt / plocka medier är nödvändiga för gott utbyte av öar med rätt integritet. En dissekera omfattning med bra kontrast och förstoring kommer också att hjälpa.
Introduction
Isolating pure pancreatic islets is essential for assaying glucose stimulated insulin secretion (GSIS) of beta cells and for islet transplantation from cadaveric donors 1-3. It is also necessary to establish endocrine gene expression in islet cells 4, 5. For this purpose, detailed protocols have been established to allow for isolation of pancreatic islets from large pancreata (6 and references therein). These methods are based on enzymatic perfusion to dissociate acinar from islet tissues, coupled with gradient separation and hand picking. Thus, islet isolation from large pancreas can be performed readily in most laboratories. On the other hand, no detailed step-by-step protocol exists to allow for the isolation of islets from pancreata that are too small to perfuse.
Studying gene expression and function of neonatal islets is important. Neonate islets have different properties from adults in insulin secretion and proliferation capability 7, 8. However, isolating islets from newly born animals, especially mice is challenging due to the small size of the newly born pancreas. The size prevents the usual perfusion process when collagenase is injected though the pancreatic duct. Indeed, several papers have presented studies along these lines, with enzyme or non-enzyme aided isolation procedures 7, 9, 10. However, detailed description of the islet isolation process with visual aid is lacking 7, 9, making it a challenge for most researchers to perform similar studies.
We have explored several different conditions that yield high quality islets from neonatal mice. Here we present a protocol that is expected to help researchers learn the key details in the islet isolation process. This protocol is applicable to mouse pancreas up to two weeks of age, after which perfusion can be performed for routine islet isolation. Islets can be directly used for insulin secretion and gene expression assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här ger vi en steg-för-steg-protokollet på holme isolering från pancreata som är för små för konventionell perfusion. Det förväntas att ge öar redo för alla ö baserade studier såsom beta-cell rening, genuttryck analys, ö betacellmognad, proliferation, cellstressreaktioner, cellöverlevnad, metabolism, och funktionell GSIS underhåll etc. Detta kommer att vara till det bästa av vår kunskap, den första detaljerade visuella protokoll som guidar nya forskare att utföra holme isolering från neona…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant from NIDDK (DK065949 for GG). We thank Dr. Brenda M. Jarvis and Jeff Duryea Jr. for reading the manuscript.
Materials
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1X HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with seusequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrfuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-ml centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-ml centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100X15 millimeter dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60X15 millimeter dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
Riferimenti
- Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
- Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
- Tonne, J. M., et al. Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy. Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).
- London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).
- Rorsman, P., et al. Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).
- Hellerstrom, C., Swenne, I. Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells. Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).
- Blum, B., et al. Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
- Hegre, O. D., et al. Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans. In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).
- Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e102445 (2015).
- White, J., White, D. C. . Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , (1997).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
