Isolamento eficaz de ilhotas funcionais a partir de ratinho neonato Pâncreas
Summary
Nós descrevemos um protocolo aqui para isolar ilhotas intactas de ratos recém-nascidos. Pâncreas foi parcialmente digerido com colagenase, seguido por lavagem e colheita manual. 20 – 80 agrupamentos de ilhéus podem ser obtidos por pâncreas de ratinhos recém-nascidos, que são adequados para vários estudos da ilhota.
Abstract
protocolos de isolamento de ilhotas-à base de perfusão de grande pâncreas de mamíferos estão bem estabelecidos. Tais protocolos estão prontamente realizado em muitos laboratórios, devido ao grande tamanho do ducto pancreático que permite a injecção pronto colagenase e subsequente perfusão tecidual. Em contraste, o isolamento de ilhotas do pâncreas pequena, como a de ratinhos neonatais, é um desafio porque perfusão não é facilmente realizável na pequena pâncreas. Aqui nós descrevemos um procedimento simples detalhado que recupera um número substancial de ilhotas de ratos recém-nascidos com assistência visual. pancreata inteiro recentemente dissecados foram digeridos com 0,5 mg / ml de colagenase IV dissolvido em Hanks 'Solução Salina Equilibrada (SSHE) a 37 ° C, em tubos de microcentrífuga. Os tubos foram aproveitado regularmente para ajudar a dispersão do tecido. Quando a maior parte do tecido foi disperso em pequenos aglomerados de cerca de 1 mM, lisados foram lavados três a quatro vezes com meio de cultura com 10% de soro fetal de bovino (FBS). aglomerados de ilhotas,desprovidas de tecidos acinares reconhecíveis, pode então ser recuperado sob dissecando estereoscópio. Este método recupera 20 – 80 pequenas e ilhotas de grande porte por pâncreas de rato recém-nascido. Estas ilhotas são adequadas para ensaios a jusante mais possíveis, incluindo a secreção de insulina, a expressão do gene, e a cultura. Um exemplo do ensaio de secreção de insulina é apresentado para validar o processo de isolamento. O fundo genético e grau de digestão são os maiores fatores determinantes do rendimento. solução de colagenase recentemente feito com alta atividade é preferível, uma vez que auxilia no isolamento endócrino-exócrina. A presença de catiões [cálcio (Ca2 +) e magnésio (Mg2 +)] em todas as soluções e soro fetal de bovino na lavagem / meios de recolha são necessárias para um bom rendimento de ilhotas com integridade adequada. Um escopo de dissecação com bom contraste e ampliação também vai ajudar.
Introduction
Isolating pure pancreatic islets is essential for assaying glucose stimulated insulin secretion (GSIS) of beta cells and for islet transplantation from cadaveric donors 1-3. It is also necessary to establish endocrine gene expression in islet cells 4, 5. For this purpose, detailed protocols have been established to allow for isolation of pancreatic islets from large pancreata (6 and references therein). These methods are based on enzymatic perfusion to dissociate acinar from islet tissues, coupled with gradient separation and hand picking. Thus, islet isolation from large pancreas can be performed readily in most laboratories. On the other hand, no detailed step-by-step protocol exists to allow for the isolation of islets from pancreata that are too small to perfuse.
Studying gene expression and function of neonatal islets is important. Neonate islets have different properties from adults in insulin secretion and proliferation capability 7, 8. However, isolating islets from newly born animals, especially mice is challenging due to the small size of the newly born pancreas. The size prevents the usual perfusion process when collagenase is injected though the pancreatic duct. Indeed, several papers have presented studies along these lines, with enzyme or non-enzyme aided isolation procedures 7, 9, 10. However, detailed description of the islet isolation process with visual aid is lacking 7, 9, making it a challenge for most researchers to perform similar studies.
We have explored several different conditions that yield high quality islets from neonatal mice. Here we present a protocol that is expected to help researchers learn the key details in the islet isolation process. This protocol is applicable to mouse pancreas up to two weeks of age, after which perfusion can be performed for routine islet isolation. Islets can be directly used for insulin secretion and gene expression assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, nós fornecemos um protocolo passo-a-passo de isolamento de ilhotas de pâncreas que são demasiado pequenos para perfusão convencional. Espera-se, para se obter ilhotas prontos para todos os estudos baseados em purificação de ilhotas, tais como beta-célula, a análise da expressão do gene, a maturação das células beta dos ilhéus pancreáticos, proliferação, as respostas de stress celular, sobrevivência celular, metabolismo, e manutenção GSIS funcional, etc. Este será, para o melhor do noss…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant from NIDDK (DK065949 for GG). We thank Dr. Brenda M. Jarvis and Jeff Duryea Jr. for reading the manuscript.
Materials
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1X HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with seusequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrfuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-ml centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-ml centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100X15 millimeter dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60X15 millimeter dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
Riferimenti
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