신생아 마우스 췌장의 기능 독도의 효과적인 분리
Summary
우리는 신생아 쥐에서 그대로 섬을 분리 본원 프로토콜을 설명합니다. Pancreata 부분적으로 세척하고 손을 따기 다음, 콜라게나로 소화했다. 20-80 아일렛 클러스터 여러 섬 연구에 적합한 새로 태어난 쥐의 췌장에 따라 얻을 수있다.
Abstract
큰 포유 동물 pancreata에서 관류 기반의 섬 – 격리 프로토콜은 잘 확립되어있다. 이러한 프로토콜은 쉽게 인해 준비 콜라겐 주입 및 이후의 조직 관류를 허용 췌관의 큰 크기로 많은 실험실에서 실시하고 있습니다. 관류 쉽게 작은 pancreata에서 얻을 수 없기 때문에 반대로, 작은 pancreata에서 섬 격리는, 신생아 쥐처럼, 도전이다. 여기에서 우리는 시각적 인 도움으로 새로 태어난 쥐에서 독도의 상당한 숫자를 복구 상세한 간단한 절차를 설명합니다. 갓 해부 전체 pancreata는 마이크로 원심 튜브에서 37 ° C에서 행크스 균형 염 용액 (HBSS)에 용해하고, 0.5 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 IV로 분해 하였다. 튜브는 조직의 분산을 돕기 위해 정기적으로 도청했다. 조직의 대부분이 1mm 주위에 작은 클러스터에 분산시킨 경우, 용 해물을 10 % 소 태아 혈청 (FBS)로 배양 배지와 서너 번 세척 하였다. 섬 클러스터,인식 선포 조직의 결여, 다음 입체경을 해부에서 복구 할 수 있습니다. 새로 태어난 마우스의 췌장 당 대형 섬에 80 소형 -이 방법은 (20)를 복구합니다. 이 섬은 인슐린 분비, 유전자 발현, 문화를 포함한 대부분의 생각할 수있는 다운 스트림 분석에 적합하다. 인슐린 분비 분석의 예는 분리 프로세스를 검증하기 위해 제공된다. 유전 적 배경과 소화의 정도는 수익률을 결정하는 가장 큰 요인이다. 이 내분비 – 외분비 격리 에이즈로 높은 활성 갓 만든 콜라겐 용액은 바람직하다. 세척의 모든 솔루션 및 소 태아 혈청에있는 양이온의 존재 [칼슘 (Ca 2+)과 마그네슘 (Mg를 2+)] / 따기 매체는 적절한 무결성 섬의 좋은 수율이 필요하다. 좋은 대조 및 확대와 해부 범위도 도움이 될 것입니다.
Introduction
Isolating pure pancreatic islets is essential for assaying glucose stimulated insulin secretion (GSIS) of beta cells and for islet transplantation from cadaveric donors 1-3. It is also necessary to establish endocrine gene expression in islet cells 4, 5. For this purpose, detailed protocols have been established to allow for isolation of pancreatic islets from large pancreata (6 and references therein). These methods are based on enzymatic perfusion to dissociate acinar from islet tissues, coupled with gradient separation and hand picking. Thus, islet isolation from large pancreas can be performed readily in most laboratories. On the other hand, no detailed step-by-step protocol exists to allow for the isolation of islets from pancreata that are too small to perfuse.
Studying gene expression and function of neonatal islets is important. Neonate islets have different properties from adults in insulin secretion and proliferation capability 7, 8. However, isolating islets from newly born animals, especially mice is challenging due to the small size of the newly born pancreas. The size prevents the usual perfusion process when collagenase is injected though the pancreatic duct. Indeed, several papers have presented studies along these lines, with enzyme or non-enzyme aided isolation procedures 7, 9, 10. However, detailed description of the islet isolation process with visual aid is lacking 7, 9, making it a challenge for most researchers to perform similar studies.
We have explored several different conditions that yield high quality islets from neonatal mice. Here we present a protocol that is expected to help researchers learn the key details in the islet isolation process. This protocol is applicable to mouse pancreas up to two weeks of age, after which perfusion can be performed for routine islet isolation. Islets can be directly used for insulin secretion and gene expression assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 기존의 관류 너무 작은 pancreata에서 섬 분리에 대한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 등과 베타 세포의 정제, 유전자 발현 분석, 췌장 베타 세포의 성숙, 증식, 세포 스트레스 반응, 세포 생존, 대사 및 작용 GSIS 유지, 모든 섬 기반 연구 준비 아일렛을 수득 할 것으로 예상된다. 이것은 우리의 지식, 신생아 쥐에서 섬 격리을 수행하는 새로운 연구를 안내하는 최초의 상세한 영상 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant from NIDDK (DK065949 for GG). We thank Dr. Brenda M. Jarvis and Jeff Duryea Jr. for reading the manuscript.
Materials
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1X HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with seusequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrfuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-ml centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-ml centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100X15 millimeter dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60X15 millimeter dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
Riferimenti
- Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
- Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
- Tonne, J. M., et al. Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy. Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).
- London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).
- Rorsman, P., et al. Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).
- Hellerstrom, C., Swenne, I. Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells. Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).
- Blum, B., et al. Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
- Hegre, O. D., et al. Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans. In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).
- Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e102445 (2015).
- White, J., White, D. C. . Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , (1997).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
