Effektiv Isolering av funksjonelle holmer fra Neonatal Mouse Pancreas
Summary
Vi beskriver en protokoll her for å isolere intakt holmer fra neonatale mus. Pankreata ble delvis spaltet med kollagenase, fulgt av vasking og håndplukking. 20 – 80 islet klynger kan fås per bukspyttkjertel fra nyfødte mus, som er egnet for flere studier holmen.
Abstract
Perfusjon baserte holme-isolasjon protokoller fra store pattedyr pankreata er godt etablert. Slike protokoller er lett utføres i mange laboratorier på grunn av den store størrelsen på bukspyttkjertelkanalen som gjør det mulig for klar kollagenase injeksjon og perfusjon påfølgende vev. I kontrast, holme isolasjon fra små pankreata, som det av neonatale mus, er utfordrende fordi perfusjon er ikke lett oppnåelig i den lille pankreata. Her beskriver vi en detaljert enkel prosedyre som gjenoppretter et betydelig antall holmer fra nyfødte mus med visuell hjelp. Ferskt dissekert hele pankreata ble spaltet med 0,5 mg / ml kollagenase IV oppløst i Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) ved 37 ° C, i mikrosentrifugerør. Rør ble tappet regelmessig for å hjelpe vev spredning. Når det meste av vevet ble dispergert til små klaser rundt 1 mm, ble lysater vasket tre til fire ganger med kulturmedium med 10% føtalt bovint serum (FBS). Holmen klynger,blottet for gjenkjennelige acinar vev, deretter kan utvinnes i henhold dissekere stereoskop. Denne metoden gjenvinner 20-80 små til store øyer pr bukspyttkjertel av nyfødte mus. Disse øyene er egnet for de fleste tenkelige nedstrøms analyser, inkludert insulin sekresjon, genekspresjon, og kultur. Et eksempel på insulinsekresjon analysen er presentert for å validere isolasjonsprosess. Den genetiske bakgrunn og grad av fordøyelse er de største faktorene som bestemmer utbyttet. Nylaget collagenase løsning med høy aktivitet er å foretrekke, som det hjelpemidler i endokrin-eksokrin isolasjon. Nærværet av kationer [kalsium (Ca2 +) og magnesium (Mg2 +)] i alle oppløsninger og føtalt bovint serum i vaske / plukking media er nødvendige for godt utbytte av øyer med riktig integritet. En dissekere omfang med god kontrast og forstørrelse vil også hjelpe.
Introduction
Isolating pure pancreatic islets is essential for assaying glucose stimulated insulin secretion (GSIS) of beta cells and for islet transplantation from cadaveric donors 1-3. It is also necessary to establish endocrine gene expression in islet cells 4, 5. For this purpose, detailed protocols have been established to allow for isolation of pancreatic islets from large pancreata (6 and references therein). These methods are based on enzymatic perfusion to dissociate acinar from islet tissues, coupled with gradient separation and hand picking. Thus, islet isolation from large pancreas can be performed readily in most laboratories. On the other hand, no detailed step-by-step protocol exists to allow for the isolation of islets from pancreata that are too small to perfuse.
Studying gene expression and function of neonatal islets is important. Neonate islets have different properties from adults in insulin secretion and proliferation capability 7, 8. However, isolating islets from newly born animals, especially mice is challenging due to the small size of the newly born pancreas. The size prevents the usual perfusion process when collagenase is injected though the pancreatic duct. Indeed, several papers have presented studies along these lines, with enzyme or non-enzyme aided isolation procedures 7, 9, 10. However, detailed description of the islet isolation process with visual aid is lacking 7, 9, making it a challenge for most researchers to perform similar studies.
We have explored several different conditions that yield high quality islets from neonatal mice. Here we present a protocol that is expected to help researchers learn the key details in the islet isolation process. This protocol is applicable to mouse pancreas up to two weeks of age, after which perfusion can be performed for routine islet isolation. Islets can be directly used for insulin secretion and gene expression assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her gir vi en steg-for-steg-protokollen på holmen isolasjon fra pankreata som er for små for konvensjonell perfusjon. Det er forventet å gi holmer klar for alle holmen baserte studier som beta-celle rensing, genekspresjonsanalyser, holme beta-cellemodning, spredning, cellestressreaksjoner, celleoverlevelse, metabolisme og funksjonell GSIS vedlikehold, osv. Dette vil være til det beste av vår kunnskap, den første detaljerte visuelle protokoll som guider nye forskere til å utføre holme isolasjon fra neona…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant from NIDDK (DK065949 for GG). We thank Dr. Brenda M. Jarvis and Jeff Duryea Jr. for reading the manuscript.
Materials
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1X HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with seusequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrfuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-ml centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-ml centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100X15 millimeter dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60X15 millimeter dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
Riferimenti
- Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
- Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
- Tonne, J. M., et al. Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy. Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).
- London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).
- Rorsman, P., et al. Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).
- Hellerstrom, C., Swenne, I. Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells. Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).
- Blum, B., et al. Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
- Hegre, O. D., et al. Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans. In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).
- Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e102445 (2015).
- White, J., White, D. C. . Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , (1997).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
