Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz
Summary
We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.
Abstract
Scramblases çift yönlü bir ATP-bağımsız bir şekilde membran çift-tabakanın fosfolipidleri transloke. İlk scramblase tespit ve biyokimyasal, fotoreseptör rodopsin apoproteini opsin edilmiştir doğrulanmış olması. Rodopsin ışık algılama sorumludur retina çubuk fotoreseptör membranlarının lokalize bir G-protein bağlı reseptördür. Rodopsin adlı scramblase faaliyeti onun ligandı 11- sis -retinal, yani bağlı değildir, apoprotein opsin da bir scramblase olarak aktiftir. karıştırıcı konstitütif ve regüle fosfolipid hücre fizyolojisinde önemli rol oynamakla birlikte, sadece bir kaç fosfolipid scramblases kadar opsin yanında tespit edilmiştir. Burada opsin en scramblase aktivitesinin bir floresans bazlı analiz tarif eder. Opsin fosfatidilkolin, fosfatidilgliserol ve flüoresan NBD-etiketli bilgisayar (1-p izi miktardan oluşan büyük tek katmanlı lipozomlar içine kuruluralmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-il) amino] heksanoil} – sn -glisero-3-fosfokolin). Scramblase aktivitesi vezikül iç broşürde bulunan NBD-PC molekülleri floresans kimyasal membranını geçemediği için bir indirgeyici madde ile elimine edilir dış yaprakçık erişebilir ne ölçüde ölçülerek belirlenir. Bu tarif yöntemler genel olarak uygulanmaktadır ve diğer membran proteinleri scramblase aktivitelerini belirlemek ve karakterize etmek için kullanılabilir.
Introduction
Fotoreseptör rodopsin (referans 1, örneğin gözden) bir prototip G protein-eşli reseptör, tanımlanacak ilk fosfolipid scramblase ve biyokimyasal olarak 2,3 sunmaktadır. Scramblases transbilayer fosfolipid hareketin özünde yavaş oranını artırmak fosfolipid taşıyıcıları olan bir çift yönlü fizyolojik uygun seviyelere, ATP-bağımsız bir şekilde 4-6. Eylemlerinin örnekleri endoplazmik retikulum ve konstitütif karıştırıcı olarak glikosilasyon yolakları 5 çeşitli zar homeostaz ve büyüme için gerekli olan bakteriyel sitoplazmik membranda bulunur. Bu gibi etki ettiği Ayarlı fosfolipid apoptotik hücrelerin yüzeyi üzerinde fosfatidilserin (PS) ortaya çıkarmak için gerekli olan her karıştırma bir makrofaj 7 -Sinyal "me-yemeği" ve protein faktörü üretimini katalize aktive kan plateletleri üzerinde prokoagülan yüzey sağlarkan pıhtılaşması için gerekli s. Fotoreseptör disk membranlarda, rodopsin en çabalıyorlar faaliyeti ATP-bağımlı, tek yönlü lipid tarafından oluşturulan iki tabakalı iki zar broşürleri arasındaki fosfolipid dengesizliği ortadan kaldırmak için önerilen ABCA4 4,8,9 10-12 Flippase edilmiştir.
Rodopsin plazma membranında PS maruz için gereken 2 + -bağımlı scramblases (referans 2, TMEM16 protein ailesinin üyeleri, Ca olarak tanımlanmıştır fotoreseptör diskleri bir scramblase olarak rapor kadar scramblases fizyolojik önemine rağmen, kimlik elde edilememiştir 13) ve bir lipid II peptidoglikan sentezinin 14 için gerekli olan scramblase gibi bakteriyel protein FtsW önerilmiştir. Bu keşifler yöntem describ Oluşan proteoliposomes lipozomlarda saflaştırılmış proteinlerin yeniden oluşturulması ve scramblase etkinliğinin gösterilmesi dayanmaktadırBurada ed. Diğer potansiyel scramblases 15-21 – peptidoglikan biyosentezinde rol MurJ ve Amj proteinleri, WzxE ve ilgili proteinler O-antijeni öncüleri karıştırıcı karışmış, MprF proteini, bakteriyel sitoplazma zarından olarak amino fosfatidilgliserol yerini değiştirmek için gerekli olan ve Xkr8 aile üyeleri önerilmiştir bu apoptotik hücre yüzeyi üzerinde PS maruz – biyokimyasal test edilmesi gerekmektedir. Bu tespit ve scramblase etkinliğini karakterize etmek sağlam bir testin önemini vurgulamaktadır.
Burada, bir floresans bazlı deney kullanılarak elde edilen proteoliposomes büyük tek tabakalı veziküller (luvs) saflaştırılmış opsin tekrar oluşturulmasını, fotoreseptör rodopsin apoprotein ve scramblase aktivitesi daha sonra analiz tarif eder. heterolog ifade ve opsin saflaştırılması için literatürde mevcut birkaç iyi tanımlanmış protokoller bu nedenle olmaz, vardırBu protokolde tarif; yaklaşık 100 ng FLAG etiketli, ısı ayarlı opsin verir Goren ve ark. 3'te tarif protokollerini kullanan /% 0.1 ul (ağırlık / hacim) dodecylmaltoside (DCM).
Sulandırma şişmeyen fakat çözünmez olduğu için, yeterli deterjan ile luvs muamele edilmesiyle elde edilmektedir. Bu koşullar altında, bir membran proteini – protein deterjan miseller halinde temin – lipozomlar entegre ve proteoliposomes sonuçlanan deterjanın alınması üzerine lipozom zarı içine yeniden hale gelir. (% 0.1 (ağırlık / hacim) DCM içinde saflaştırılmış proteini olarak elde edilmiştir) opsin tekrar oluşturmak için, LUVler POPC (1-palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3-fosfokolin) ve POPG karışımı (1-hazırlanır palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3- [fosfo-rak- (1-gliserol)]) ve opsin ve NBD-PC eklemeden önce DDM ile doyuruldu. Deterjan daha sonra polistiren boncuklar ile örnek muamele etmek suretiyle uzaklaştırılır.
<p c lass = "jove_content"> floresans bazlı analiz temel ilkesi Şekil 1B 'de gösterilmiştir. Luvs simetrik NBD-PC veya diğer NBD etiketli floresan fosfolipid muhabiri (Şekil 1A) bir eser miktarı ile yeniden edilmektedir. ditionit ilave üzerinde NBD nitro grubu gibi bir zar geçirgenliği olmayan dianyon, luvs dış broşürde NBD-PC molekülleri işlenen floresan olmayan bir floresan olmayan amino grubuna indirgenir. de NBD-PC molekülleri de ditiyonit deneyi (<10 dakika), zaman ölçeğinde membran hareket mümkün olduğundan, bu floresan sinyalin% 50 azalma ile sonuçlanır. Lipozomlar, bir scramblase ile yeniden Ancak, eğer, iç yaprakçıkta NBD-PC moleküller azaltılır dış hızla karıştırmak olabilir. Bu ideal bir durumda (Şekil 1C) floresans toplam kayıp ile sonuçlanır.ES / ftp_upload / 54.635 / 54635fig1.jpg "/>
. Şekil 1: scramblase aktivite deneyinin şematik temsili tahlil, bir flüoresan NBD-etiketli raportör lipid kullanır; NBD-PC gösterilmiştir (A). Büyük tek tabakalı veziküller NBD-PC'nin eser miktarı ile tekrar kurulmuştur. Sulandırma dış ve iç broşürlerde eşit olarak dağıtılır NBD-PC ile, simetrik veziküller üretir. Ditiyonit (S2 O 4 2-) kimyasal olmayan bir floresan amino grubuna NBD nitro grubunu azaltır. Ditiyonit (B, yukarıda) ile birlikte protein içermeyen lipozomlar tedavisi azaltılır, dış sayfada tek NBD-PC moleküllerinin floresan bir% 50 azalmaya neden olan: ditiyonit negatif yüklü ve NBD-PC molekülleri ile tepkimeye zarı geçemez iç broşürde. Opsin içeren proteoliposomes (B, alt), bir ditiyonit tedavi, yani scramblase aktif proteoliposomes, f% 100 kaybına yol açaropsin olarak luorescence iç ve dış broşürde arasında NBD-PC hareketini kolaylaştırır. (C) ditionit ile protein içermeyen lipozomlar ve opsin içeren proteoliposomes tedavi elde edilen idealize floresan izlerini gösterir. floresans kaybı oranı ditionit ile NBD kimyasal indirgeme karıştırıcı kimyasal tepkime oranından daha büyük veya eşit bir hızda gerçekleşir, ve bu oran-sınırlayıcı olduğunu gösteren her iki durumda da aynıdır. Gerçek bir deneyde elde edilen izleri Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bu tarif yöntemleri diğer saflaştırılmış proteinleri, hem de deterjan 22 mikrozomları ekstre, örneğin, elde edilen zar proteinlerinin karışımlarını sulandırmak ve analiz etmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Scramblase etkinlik tahlili olduğu opsin fosfolipid scramblase aktivitesi 2 bulunmaktadır belirlemek için ilk olarak sağladı. Tahlil da bize özgüllük test ederek opsin en scramblase etkinliğini karakterize izin (biz böyle Şekil 1A NBD-PC için gösterilen, ya da gibi bir asil zinciri üzerindeki NBD ile etiketlenmiş NBD-fosfatidiletanolamin olarak NBD etiketli muhabiri lipidlerin çeşitli kullanılan ana grup, NBD-sfingomiyelin veya NBD- fosfatidilserin 2), vezikül li…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) and the Austrian Science Fund (FWF) project J3686 (B.P.).
Materials
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840457C | POPG |
| 1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 810130C | NBD-PC |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | VWR Scientific | EM-5330 | HEPES |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | NaCl |
| Dodecyl-β-d-maltoside | Anatrace | D310 5 GM | DDM |
| Fluorimeter cuvettes | sigma | C0918-100EA | cuvettes |
| Spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. | fluorimeter | |
| Sodium hydrosulfite technical grade, 85% | Sigma | 157953-5G | dithionite |
| GraphPad Prism 5 software | Prism | ||
| Tris Base | VWR | JTX171-3 | Tris |
| LIPEX 10 mL extruder | Northern Lipids, Inc. | Extruder | |
| Whatman, Drain disc, PE, 25 mm | Sigma | 28156-243 | Disc support |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110607 | 400 nm membrane |
| Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110606 | 200 nm membrane |
| sodium phosphate | Sigma | S3264-500G | |
| VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13×100 mm | VWR Scientific | 47729-572 | glass tubes |
| Perchloric acid | Sigma | 30755-500ML | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma | A-7302 | ammonium molybdate |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A7631-25G | sodium ascorbate |
| Bio-Beads SM2 adsorbents | Bio Rad | 1523920 | polystyrene beads |
| 2.0 mL Microtubes clear | VWR Scientific | 10011-742 | Reconstitution tubes |
| Reconstitution glass tube | VWR Scientific | 53283-800 | Reconstitution glass tubes |
| Zetasizer | Malvern | DLS | |
Riferimenti
- Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).
- Goren, M. A., et al. Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor. Nat. Commun. 5, 5115 (2014).
- Ernst, O. P., Menon, A. K. Phospholipid scrambling by rhodopsin. Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).
- Sanyal, S., Menon, A. K. Flipping lipids: why an’ what’s the reason for?. ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).
- Bevers, E. M., Williamson, P. L. Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).
- Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
- Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer. Nat. Commun. 3, 925 (2012).
- Quazi, F., Molday, R. S. ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).
- Ben-Shabat, S., et al. Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).
- Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids. J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).
- Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions. J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).
- Mohammadi, T., et al. Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane. EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).
- Meeske, A. J., et al. MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).
- Ruiz, N. Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis. Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).
- Rick, P. D., et al. Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).
- Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis. J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).
- Suzuki, J., Nagata, S. Phospholipid scrambling on the plasma membrane. Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).
- Alaimo, C., et al. Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J. 25, 967-976 (2006).
- Ernst, C. M., Peschel, A. Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).
- Vehring, S., et al. Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins. Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).
- Rouser, G., et al. Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5, 494-496 (1970).
- Rigaud, J. -. L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
- Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).
- Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochimica. 20, 833-840 (1981).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nat. Commun. 4, 2367 (2013).
- Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids. Biochem. J. 389, 517-526 (2005).
- Marek, M., Günther-Pomorski, T. Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives. Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).
- Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes. J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).
- Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).
- Romsicki, Y., Sharom, F. J. Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter. Biochimica. 40, 6937-6947 (2001).
- Zhou, X., Graham, T. R. Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).
