Un test basé sur la fluorescence de phospholipides scramblase Activité

La rhodopsine photorécepteur, un récepteur de protéine G couplée à prototypique ( passage en revue par exemple dans la référence ^1), est le premier phospholipide scramblase à identifier et biochimiquement vérifiée ^2,3. Scramblases phospholipides sont des transporteurs qui augmentent le taux intrinsèquement lent du mouvement transbilayer phospholipide physiologiquement niveaux appropriés dans une bi – directionnelle, de façon ATP-indépendant ^6/4. Des exemples de leurs actions peuvent être trouvées dans le réticulum endoplasmique et de la membrane cytoplasmique bactérienne , où le brouillage constitutif est nécessaire pour l' homéostase de la membrane et la croissance, ainsi que pour une variété de voies de glycosylation ^5. Phospholipide régulé embrouillage est nécessaire d'exposer la phosphatidylsérine (PS) à la surface des cellules apoptotiques où il agit comme un «eat-moi» -signal pour les macrophages ⁷ et fournit une surface procoagulante sur les plaquettes sanguines activées pour catalyser la production de facteur protéiques nécessaire pour la coagulation sanguine. Dans les membranes du disque photoréceptrices, l'activité de brouillage de la rhodopsine a été suggéré pour contrebalancer le déséquilibre phospholipide entre les deux feuillets de la membrane bi – couche qui est générée par l'ATP-dépendante, un lipide unidirectionnel flippase ABCA4 ^{4,8,9 10-12.}

En dépit de l'importance physiologique de scramblases, leur identité est restée difficile à atteindre jusqu'à ce que la rhodopsine a été rapportée en tant que scramblase dans les disques photorécepteurs ^2, des membres de la famille des protéines TMEM16 ont été identifiés comme ^{Ca2 +} scramblases -dépendantes nécessaires pour une exposition de PS à la membrane plasmique (passé en revue dans la référence ^13), et la protéine bactérienne FTSW a été proposée comme un lipide II scramblase nécessaire pour la synthèse du peptidoglycane ^14. Ces découvertes ont été basés sur la reconstitution de protéines purifiées dans des liposomes et la démonstration de l'activité de scramblase dans les protéoliposomes résultant en utilisant la méthodologie described ici. Autres scramblases potentiels ^15-21 – les protéines MurJ et AMJ impliqués dans la biosynthèse de peptidoglycane, WzxE et protéines apparentées impliquées dans le brouillage des précurseurs de O-antigène, la protéine MPRF nécessaire pour la translocation phosphatidylglycérol aminoacyle à travers la membrane cytoplasmique bactérienne, et les membres de la famille Xkr8 qui ont été proposées exposer PS à la surface des cellules apoptotiques – restent à tester biochimiquement. Cela souligne l'importance d'un test robuste pour identifier et caractériser l'activité scramblase.

Ici, nous décrivons la reconstitution de l'opsine purifiée, l'apoprotéine de la rhodopsine photorécepteur, en grandes vésicules unilamellaires (LUV), et l'analyse ultérieure de l'activité de scramblase dans les protéoliposomes résultant en utilisant un dosage basé sur la fluorescence. Il existe plusieurs protocoles bien décrits dans la littérature pour l'expression hétérologue et la purification de l'opsine, donc nous ne serons pasdécrire dans ce protocole; on utilise les protocoles décrits dans Goren et al. , ce qui donne ³ étiquetée FLAG, opsine thermostable à environ 100 ng / ul de 0,1% (p / v) , dodécylmaltoside (DDM).

La reconstitution est obtenue par traitement avec un détergent LUV suffisante pour qu'ils gonflent mais ne se dissolvent pas. Dans ces conditions, une protéine membranaire – fourni sous forme de micelles protéine-détergent – intégrera dans les liposomes et devient reconstituée dans la membrane des liposomes lors de l'élimination de détergent, ce qui entraîne des protéoliposomes. Pour reconstituer opsine (obtenu sous la forme d' une protéine purifiée dans 0,1% (p / v) DDM), LUV sont préparés à partir d' un mélange de POPC (1-palmitoyl-2-oléoyl – sn – glycéro-3-phosphocholine) et le POPG (1- palmitoyl-2-oléoyl sn – glycéro-3- [phospho-rac- (1-glycérol)]) et saturé avec DDM avant d' ajouter opsin et NBD-PC. Le détergent est ensuite éliminé par traitement de l'échantillon avec des billes de polystyrène.

<p c lass = "jove_content"> Le principe de l'essai à base de fluorescence est représentée sur la figure 1B. LUV sont symétriquement reconstitués avec une trace de NBD-PC ou un autre journaliste de phospholipides fluorescent NBD marqué (figure 1A). Par addition de dithionite, un non-fluorescente à la membrane impermeant dianion, les molécules NBD-PC dans le feuillet externe des GVU sont rendus en tant que groupe nitro du NBD est réduite à un groupe amino non fluorescent. Étant donné que ni les molécules NBD-PC ni dithionite sont capables de traverser la membrane sur l'échelle de temps de l'expérience (<10 min), il en résulte 50 une réduction du signal fluorescent%. Cependant, si les liposomes sont reconstituées avec une scramblase, les molécules NBD-PC dans le feuillet interne peut mélanger rapidement vers l'extérieur où ils sont réduits. Cela se traduit par la perte totale de la fluorescence dans le cas idéal (figure 1C).

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. Figure 1: Représentation schématique de l'essai d'activité scramblase L'essai utilise un marqueur fluorescent rapporteur lipide NBD-marqué; NBD-PC est disponible (A). De grosses vésicules unilamellaires sont reconstituées avec une quantité trace de NBD-PC. Reconstitution produit des vésicules symétriques, avec NBD-PC répartis également dans les dépliants extérieurs et intérieurs. Dithionite (S ₂ O ₄ ^2-) réduit chimiquement le groupe nitro du NBD à un groupe amino non fluorescent. Traitement des liposomes sans protéines avec du dithionite (B, en haut) provoque une réduction de la fluorescence de 50% depuis que les molécules NBD-PC dans le feuillet externe sont réduits: dithionite est chargé négativement et ne peut pas traverser la membrane pour réagir avec des molécules NBD-PC dans le feuillet interne. Traitement dithionite de protéoliposomes contenant opsin-(B, bas), à savoir, protéoliposomes de scramblase-actif, entraîne la perte de f 100%luorescence comme opsin facilite le mouvement de NBD-PC entre l'intérieur et l'feuillet externe. (C) montre des traces de fluorescence idéalisées obtenus sur le traitement des liposomes dépourvus de protéine et protéoliposomes contenant opsin-dithionite. Le taux de perte de fluorescence est le même dans les deux cas, ce qui indique que la réduction chimique du NBD par le dithionite est le taux limitatif, et que le brouillage se produit à une vitesse égale ou supérieure à la vitesse de la réaction chimique. Des traces obtenues à partir d' une expérience réelle sont présentés dans la figure 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les procédés que nous décrivons peuvent être utilisées pour reconstituer et doser d' autres protéines purifiées, ainsi que des mélanges de protéines membranaires obtenues, par exemple, par extraction avec un détergent ²² microsomes.