Manipolazione Ploidia di embrioni di zebrafish con Heat Shock 2 Trattamento
Summary
Un protocollo modificato per la manipolazione ploidia utilizza uno shock termico per indurre una stalla di un ciclo in cytokinesis in embrione precoce. Questo protocollo è illustrato nel zebrafish, ma può essere applicabile ad altre specie.
Abstract
Manipolazione di ploidia permette trasformazioni utili, come diploidi a tetraploidi, o aploidi a diploidi. Nella rerio Danio zebrafish, in particolare la generazione di diploidi gynogenetic omozigoti è utile in analisi genetica perché permette la produzione diretta di omozigoti da un'unica madre eterozigote. Questo articolo descrive un protocollo modificato per la duplicazione di ploidia base ad un impulso di calore durante il primo ciclo cellulare, Heat Shock 2 (HS2). Attraverso l'inibizione della duplicazione centriole, questo metodo si traduce in una precisa stalla divisione cellulare durante il secondo ciclo cellulare. La precisione di un ciclo di divisione stallo, accoppiato ad inalterato duplicazione del DNA, si traduce in tutta la duplicazione del genoma. Protocolli associati a questo metodo includono uovo e la raccolta dello sperma, il trattamento UV di sperma, la fecondazione in vitro e impulso di calore per provocare una sola cella di ritardo divisione del ciclo e la duplicazione di ploidia. potrebbe essere applicata una versione modificata di questo protocolloper indurre cambiamenti di ploidia in altre specie animali.
Introduction
Questo protocollo permette la manipolazione di ploidia in embrioni di zebrafish, come ad esempio la generazione di diploidi omozigoti gynogenetic da aploidi gynogenetic (Figura 1) o la produzione di tetraploidi. Questo risultato è ottenuto inducendo un ritardo nella citochinesi corrispondente precisamente a un ciclo cellulare (Figura 2A, 2B). La chiave di ritardo di un ciclo in citocinesi è ottenuta mediante trattamento con shock termico. Il protocollo standard di shock termico (HS) come originariamente descritto da Streisinger e colleghi coinvolto un impulso temperatura durante il periodo di 13-15 MPF, risultando in un unico ciclo di divisione cellulare stallo durante il primo ciclo cellulare 1. L'efficienza di questo protocollo è stato recentemente migliorato dalla scansione dei primi cicli cellulari con una finestra temporale scorrevole di trattamento shock termico. Questa scansione individuato un punto secondo momento per una scossa di calore, ancora all'interno del primo ciclo cellulare (22-24 MPF), che si traduce in un più alto tasso di embryo con un ciclo di divisione cellulare di stallo, che in questo caso riguarda il secondo ciclo cellulare 2. L'osservazione che le manipolazioni sperimentali durante il primo ciclo cellulare interferiscono con la divisione cellulare durante il secondo ciclo cellulare e provocano DNA duplicazione di contenuti è stata riportata anche in altre specie di pesci 3,4. Ci riferiamo a questo protocollo modificato come Heat Shock 2 (HS2 – il termine "2" indica che l'impulso di calore avviene in un punto temporale entro il metodo HS standard e che il ritardo del ciclo cellulare causata da HS2 si verifica durante il secondo ciclo cellulare ). Questi studi hanno dimostrato che la base di arresto citochinesi dopo shock termico è l'inibizione della duplicazione centriole durante l'impulso di calore, che influenza la formazione del fuso e induzione solco nella seguente ciclo cellulare. Risultati HS2 rendimenti di arresto del ciclo cellulare si avvicinano al 100%, e tassi di ploidia duplicazione fino a 4 volte superiore rispetto HS di serie 2.
ingegno embrioni trattatiha shock termico durante cella ciclismo blastomeri presentano molti effetti deleteri, suggerendo che shock termico colpisce di più processi necessari per la divisione cellulare 2. D'altra parte, se lo shock termico è applicato prima dell'inizio del ciclo cellulare (periodo 0-30 MPF), sembra avere effetti coerenti con interferenza specifico con duplicazione centriolo e non sembra influenzare altri processi cellulari essenziali 2 . Questi studi hanno dimostrato che il tempo prima dell'inizio della divisione blastomere sembra essere un periodo di sviluppo suscettibili di utilizzare shock termico come strumento per manipolare specificamente ploidia attraverso l'inibizione centriolo. La causa di fondo della selettività apparente per shock termico sulla duplicazione centriolo è sconosciuta, ma può essere correlato a una degradazione selettiva delle sottostrutture centrosoma osservati in condizioni di stress termico in alcuni tipi di cellule, come i leucociti 5.
la sincronizzazione temporale di embrionale deluppo è ottenuta tramite fecondazione in vitro (IVF). L'uso di sperma non trattata durante i risultati di fecondazione in embrioni diploide che al momento HS2 indotto un ciclo cytokinesis stallo diventare tetraploide. L'uso di sperma UV-trattati, che porta legami crociati che inattivano il suo DNA, risultati in embrioni aploidi gynogenetic 6, che su HSII indotto un ciclo cytokinesis stallo diventare diploidi gynogenetic 2. A causa del conseguente tutta la duplicazione del genoma, le diploidi gynogenetic ultime siano omozigoti ad ogni singolo locus in tutto il genoma. Per brevità, ci riferiamo a gynogenetic embrioni aploidi come "aploidi", e omozigoti embrioni diploidi gynogenetic come "diploidi omozigoti". Se vitale e fertile, diploidi omozigoti possono essere utilizzate per avviare le linee sterili e letali-libera. omozigosi diretta indotta da HS2 dovrebbe anche essere facilmente incorporato in analisi genetica o schermi genetici, dal momento che diploidi omozigoti dalle femmine che sono portatori eterozigoti di Mutzioni tariffe espositive di omozigosi a (50%) e alti rapporti fissi 2.
Il seguente protocollo descrive passaggi per eseguire HS2 e indurre la duplicazione ploidia con piena omozigosi. Per la produzione tetraploide, soluzione sperma dovrebbe essere trattata. Per la produzione diploide omozigote, lo sperma deve essere inattivato per il trattamento UV. Inoltre, come descritto nella discussione, marcatori pigmento visibili possono anche essere utilizzati per facilitare l'identificazione di diploidi omozigoti. Compagno di Zebrafish principalmente durante i primi 3 hr di inizio del loro ciclo di luce 7, e adulti e le uova sono sensibili ai ritmi circadiani 8, quindi per ottenere i migliori risultati della procedura di fecondazione in vitro dovrebbe avvenire entro questo periodo di tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
passaggi critici
E 'fondamentale per lavorare in condizioni di effettivo fecondazione in vitro. Per assicurare una buona scorta di uova mature (step 1), le femmine impostati per l'accoppiamento non avrebbe dovuto essere istituito nel croci di accoppiamento per almeno 5 giorni e dovrebbe apparire gravide. Durante l'interruzione di allevamento, un osservatore può monitorare 15-30 carri armati in modo adeguato per la prima apparizione di estrusione uovo naturale. Interruzione di accop…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants R21 HD068949-01 and RO1 GM065303.
Materials
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Pipetteman P-1000 | any maker | ||
| Pipette tips 1000 µl | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (cat No. UVP18006201) | available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting) |
| UV glasses | any maker | ||
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| Tea strainer | available in kitchen stores | ||
| beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| water bath (2) | any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series) | ||
| Hanks’ Solution 1 | see above | see above | 8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 2 | see above | see above | 0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 4 | see above | see above | 0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 5 | see above | see above | 1.23g MgSO4 ∙ 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hank's Premix | see above | see above | add, in the following order: 10.0 ml Solution 1; 1.0 ml Solution 2; 1.0 ml Solution 4; 86.0 ml ddH2O; 1.0 ml Solution 5. Store at 4°C |
| Hanks’ Solution 6 | see above | see above | 0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure. |
| Hank's Solution (final solution) | see above | see above | Combine 990ul of Hank’s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution) |
Riferimenti
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