Manipulation Ploïdie de Zebrafish Embryons avec Heat Shock Treatment 2

Ce protocole permet la manipulation des embryons de poisson zèbre dans la ploïdie, tels que la génération de diploïdes gynogénétiques homozygotes à partir haploïdes gynogénétiques (figure 1) ou la production de tétraploïdes. Ceci est réalisé en induisant un retard dans la cytocinèse correspondant exactement à un cycle cellulaire (figure 2A, 2B). Le retard touche un cycle cytokinèse est obtenu par le traitement par choc thermique. Le protocole standard de choc thermique (HS) tel que décrit à l' origine par Streisinger et ses collègues impliqués une impulsion de température au cours de la période mpf 13-15, résultant en une un cycle de la division cellulaire décrochage au cours du premier cycle cellulaire ^1. L'efficacité de ce protocole a été récemment améliorée par balayage des cycles cellulaires début d'une fenêtre temporelle de glissement du traitement par choc thermique. Cette analyse a identifié un point de temps plus tard pour un choc thermique, toujours dans le premier cycle cellulaire (22-24 mpf), qui se traduit par un taux de embr supérieuryos avec un cycle de division cellulaire décrochage, qui dans ce cas affecte le second cycle cellulaire ^2. L'observation selon laquelle des manipulations expérimentales pendant le premier cycle cellulaire interfèrent avec la division cellulaire au cours du deuxième cycle cellulaire et provoquer la duplication de l' ADN contenu a également été rapporté dans d' autres espèces de poisson ^3,4. Nous nous référons à ce protocole modifié comme Heat Shock 2 (HS2 – le terme «2» signifie que l'impulsion de chaleur se produit à un moment ultérieur de la méthode de HS standard, et que le retard du cycle cellulaire causé par HS2 se produit au cours du deuxième cycle cellulaire ). Ces études ont montré que la base de la cytokinèse arrestation après un choc thermique est l'inhibition de la duplication centriole pendant l'impulsion de chaleur, ce qui affecte la formation du fuseau et de l'induction sillon dans le cycle cellulaire suivant. Résultats HS2 des rendements de l' arrêt du cycle cellulaire approchant les 100%, et les taux de ploïdie duplication jusqu'à 4 fois plus élevé que la norme HS ^2.

wit Embryons traitésha choc thermique au cours blastomère cycle cellulaire présentent de nombreux effets délétères, ce qui suggère que le choc thermique affecte plusieurs processus nécessaires à la division cellulaire ^2. D'autre part, si le choc thermique est appliqué avant le début du cycle cellulaire (période de temps 0-30 mpf), il semble avoir des effets cohérents avec l' interférence spécifique avec la duplication centriole et ne semble pas affecter d' autres processus cellulaires essentiels ² . Ces études ont montré que le temps avant le début de la division blastomère semble être une période de développement prête à l'utilisation de choc thermique comme un outil pour manipuler spécifiquement ploïdie par inhibition centriole. La cause sous – jacente de la sélectivité apparente pour le choc thermique sur la duplication centriole est inconnue, mais peut être liée à une dégradation sélective des structures centrosome observées sous contrainte thermique dans certains types de cellules, telles que les leucocytes ^5.

synchronisation temporelle de l'embryon dedéveloppement est réalisé par la fécondation in vitro (FIV). Utilisation du sperme non traité au cours des résultats de fécondation chez les embryons diploïdes que lors de HS2-induits d'un cycle cytokinesis décrochage se tétraploïde. Utilisation des traités-UV sperme, qui porte réticulations qui inactivent son ADN, les résultats dans les embryons haploïdes gynogénétiques ^6, qui , après HSII induite par un cycle cytokinesis décrochage devenir diploïdes gynogénétiques ^2. En raison de la duplication du génome entier résultant, ce dernier diploïdes gynogénétiques sont homozygotes à chaque locus unique à travers le génome. Pour la concision, nous nous référons à gynogénétiques embryons haploïdes comme «haploïdes», et les embryons diploïdes homozygotes gynogénétiques que "diploïdes homozygotes". Si viables et fertiles, les diploïdes homozygotes peuvent être utilisés pour initier des lignes stériles et létaux-libre. homozygotie directe induite par HS2 devrait également être facilement incorporé dans l'analyse génétique ou écrans génétiques, depuis diploïdes homozygotes des femelles qui sont porteurs hétérozygotes de mutations taux d'exposition de homozygotie à (50%) ² ratios élevés et fixes.

Le protocole suivant décrit les étapes à effectuer HS2 et induire la duplication ploïdie en pleine homozygotie. Pour la production tétraploïde, solution de sperme doit être traitée. Pour la production diploïdes homozygotes, le sperme doit être inactivé par traitement UV. En outre, comme il est décrit dans l'analyse, des marqueurs de pigment visible peuvent également être utilisés pour faciliter l'identification des diploïdes homozygotes. Compagnon Zebrafish principalement durant les 3 premières heures de l'ouverture de leur cycle de lumière ^7, et les deux adultes et les œufs sont sensibles aux rythmes circadiens ^8, donc pour obtenir les meilleurs résultats de la procédure de FIV devrait avoir lieu dans cette période de temps.