The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.
Hemos construido lineales cerrados covalentemente minivectors (LCC) de ADN como un gen de entrega alternativa vector no viral producido a través de una plataforma sencilla in vivo. Ministrings de ADN poseen un perfil de seguridad elevado y también proporcionan de manera eficiente la carga de ADN a las células diana. vectores de ADN convencionales llevan secuencias procarióticas indeseables, incluyendo genes de resistencia a antibióticos, motivos CpG, y orígenes bacterianos de replicación, que puede conducir a la estimulación de las respuestas inmunológicas host. La biodisponibilidad de vectores de ADN convencionales también se ve comprometida debido a su tamaño molecular más grande. Su naturaleza circular puede impartir también la integración cromosómica, que conduce a la mutagénesis de inserción.
secuencias bacterianas se escindieron de minivectors de ADN, dejando sólo el gen de interés (GOI) y elementos de expresión eucariotas necesarios. Nuestros minivectors ADN LCC, o ministrings de ADN, están desprovistos de secuencias bacterianas inmunogénicas; por lo tanto, la mejora de THEIR biodisponibilidad y la expresión GOI. En el caso de la integración del vector en el cromosoma, la MiniString ADN LCC se letalmente interrumpir el cromosoma del huésped, eliminando de este modo el mutante potencialmente peligrosa de la población de células en proliferación. En consecuencia, ministrings de ADN ofrecen los beneficios de ADN 'minicircle' al tiempo que elimina el potencial de eventos de integración vector indeseables. En comparación con los plásmidos convencionales y sus contrapartes isogénicas circulares cerradas covalentemente (CCC), ministrings ADN demuestran una biodisponibilidad superior, la eficiencia de transfección, y la cinética citoplasmáticos – que por lo tanto requieren menores cantidades de tensioactivos catiónicos para la transfección eficaz de células diana.
Hemos construido un solo paso inducible sistema in vivo para la producción de ministrings de ADN en Escherichia coli que es fácil de usar, rápido y escalable.
El objetivo es producir cantidades escalables de lineal cerrado covalentemente minivectors (LCC) de ADN usando un sistema simple y de alta eficiencia de un solo paso inducible por calor in vivo de ADN de producción MiniString. ministrings de ADN proporcionan una estrategia no viral seguro y eficaz para suministrar el ADN. Se combinan la seguridad de los vectores de LCC con la eficiencia de minicircles de ADN, y también ofrecen una alternativa más segura a los vectores derivados de virus sin comprometer la eficiencia de la transfección.
Para que un sistema de suministro de transgén para tener éxito, el vector de ADN debe entrar en la célula huésped diana y expresar el transgén (s) codificada. Hay varias barreras celulares que hay que superar en la práctica, en particular en los sistemas de mamíferos. Con el fin de evitar la degradación por nucleasas de suero y la detección inmune por el sistema retículo-endotelial, el vector de ADN debe ser bio- y compatible-inmune con sistema de destino. ADN sin protección es digerida rápidamente por las nucleasas de plasmay la membrana plásmido se compone de barreras de lipoproteínas densas por lo que el vector de ADN debe ser capaz de atravesar rápidamente la membrana plasmática de las células diana. Una vez en la célula, los vectores deben atravesar el citoplasma y pasar a través de la membrana nuclear para entrar en el núcleo para la expresión del transgen. técnicas de suministro de genes no virales se centran en la mejora de los tejidos y las células de metas. Sin embargo, el uso de plásmidos convencionales con estas técnicas reduce la eficacia de transfección debido a la presencia de secuencias bacterianas inmunogénicas, que silencia rápidamente la expresión génica 1,2. plásmidos convencionales suelen llevar los genes de resistencia a antibióticos para el mantenimiento en los sistemas procariotas. Sin embargo, éstos pueden producir efectos adversos potenciales en huéspedes humanos o conferir resistencia a la flora natural de acogida a través de los efectos de transferencia horizontal de genes. Plásmidos convencionales también contienen dinucleótido CpG motivos 2, que puede desencadenar una respuesta inmunoestimuladora no deseado, potencialmentela reducción o silenciamiento de la expresión del transgen.
A medida que se exclusivamente compuestos por el casete de expresión eucariota, minivectors ADN, tales como minicircles de ADN 3, son una mejor alternativa para la entrega de genes, ya que muestran una biodisponibilidad mejorada extracelular e intracelular y la mejora de la expresión de genes debido a su tamaño reducido y la ausencia de elementos procariotas inmunoestimulantes 4. Las tarifas de tamaño reducido vector mejor con respecto a la resistencia a las fuerzas de cizallamiento asociadas con la administración in vivo a un sitio diana 5. El mayor número de copias del vector por unidad de masa requiere menos reactivo de transfección, disminuyendo así la toxicidad. Sin embargo, en el caso de la integración vector aleatorio en un cromosoma huésped, circular cerrado covalentemente vectores (CCC), incluyendo tanto minicircles de ADN y plásmidos convencionales, impartir continuidad molecular y por lo tanto puede conducir a la mutagénesis de inserción, lo que puede tener consecuencias devastadoras <sarriba> 6. Comparativamente, la integración de un vector de ADN lineal interrumpe el cromosoma e inicia vías de muerte celular, eliminando de este modo la célula mutante de la población de células en proliferación y la prevención de la mutagénesis de inserción 7. La expresión de genes inmunológicamente definido (MIDGE) vectores minimalistas 8 y vectores micro-lineal 9 (MiLV) son vectores de ADN LCC desarrollados in vitro. Vectores MIDGE han mostrado hasta un expresión del transgen mejorado 17 veces in vivo en comparación con ADN de plásmido convencional vectores 11, y han demostrado resultados prometedores en la terapia génica de la vacuna 10 y el cáncer 8. Además, debido a la estructura libre de torsión de la minivector LCC, se requiere menos reactivo de transfección en comparación con la contraparte CCC superenrollado, reduciendo así la toxicidad 7.
Nuestros vectores de ADN LCC mejorados, ministrings de ADN, han demostrado eficacia de expresión superior y bioavailabilidad 7. Además, ministrings de ADN se producen en un sistema de un solo paso inducible por calor in vivo la producción, una alternativa conveniente y rentable de MIDGE y MiLV LCC vectores, que requieren varios pasos en vitro. El sistema de producción MiniString ADN que ser demostrada es un proceso inducible por calor sencillo realizado in vivo, lo que es tanto rentable y fácilmente escalable. Este sistema aprovecha la Yersinia enterocolitica bacteriófago PY54 derivado de Tel / PAL protelomerase sistema de recombinación 12 para separar el casete de expresión eucariota mínima por parte del esqueleto del plásmido procariota. Hemos diseñado Escherichia coli células (W3NN) para expresar Tel protelomerase bajo el control del promotor del bacteriófago λ-inducible por calor, cI [Ts] 857 13. Tras la expresión, Tel protelomerase actúa sobre sitios diana pal presentes dentro de "Super Sequence" (SS) sitios ubicados en el plásmido precursorpara dar productos de LCC, de los cuales el MiniString ADN puede entonces ser purificado (Figura 1). Los sitios de la SS en el plásmido precursor MiniString ADN también codifican sitios diana para otras recombinasas incluyendo la recombinasa Cre (LOX), TELN protelomerase (telRL) y Flp recombinasa (FRT), facilitando de este modo la producción de LCC isogénicas y minivectors CCC de un plásmido precursor. Además, cada sitio SS está flanqueado en ambos lados por secuencias de SV40 Enhancer (SV40E), que sirven para mejorar la translocación nuclear 14. Hemos demostrado en otro lugar que la adición sucesiva de SV40E confiere progresivamente los correspondientes incrementos en la eficiencia de la transfección 7. El plásmido precursor (pDNA MiniString o PDMS) contiene un polienlazador (Figura 1) para facilitar la inserción de cualquier gen deseado de interés en fusión transcripcional con el reportero fluorescente verde (GFP).
La tecnología de ADN pueden minivectorser utilizado en lugar de los métodos convencionales para la transferencia de genes, la expresión de genes informadores, y las evaluaciones hacia la eficacia de la expresión del transgen en los sistemas eucariotas. ministrings ADN combinan la biocompatibilidad y el aumento de los beneficios de la eficiencia de transfección de vectores "mini" con el perfil de seguridad superior de vectores de ADN lineales. Nuestra sólida plataforma de producción de un solo paso con rapidez y facilidad produce ministrings de ADN para cualquier aplicación de la transferencia de genes y ofrece un perfil de seguridad superior.
Se describe aquí un sistema simple para la producción de ADN ministrings LCC utilizando un protocolo inducible por calor de un solo paso, que no requiere ningún equipo especial aparte de la que se usa en el crecimiento y la manipulación bacteriana típica. ministrings de ADN están libres de torsión y estables casetes de expresión de ADN lineales, desprovistos de elementos genéticos procariotas. Se pueden usar en lugar de los métodos convencionales para la transferencia de genes, la expresión de genes indicadores, así como en las evaluaciones hacia la eficacia de la expresión del transgen en los sistemas eucariotas. ministrings ADN combinan la biocompatibilidad y el aumento de los beneficios de la eficiencia de transfección de vectores "mini" con el perfil de seguridad superior de vectores de ADN lineales. Nuestra sólida de un solo paso en la plataforma de producción in vivo rápidamente y fácilmente produce ministrings de ADN para cualquier aplicación de la transferencia de genes sin la necesidad de múltiples procesos costosos en vitro.
Hay varios pasos críticos paraasegurar una producción óptima MiniString (Figuras 2 y 3). la inducción de calor es el paso más crítico para la producción Ministring. la falta completa de MiniString producción es más probable debido a la falta de inducción de calor (células retenidas a 30 ° C), donde la represión de la expresión protelomerase impide la conversión del plásmido precursor de MiniString LCC. Siguiendo el protocolo de inducción de calor, le espera una eficiencia de producción de aproximadamente 75%. la inducción de calor es óptima mientras que las células están en la fase de registro. Aunque no existe una diferencia estadísticamente significativa en Ministring PE utilizando las células en fase estacionaria ( "Overgrown", Figura 3), lo hicimos observar casi un 50% de disminución en el rendimiento global del plásmido. Los rendimientos dependerán del protocolo de extracción de plásmido utilizado. Para la producción óptima MiniString, desencadenar la inducción de calor mientras que las células están en la fase de registro. la producción MiniString pobres será muy probablemente un resultado de aumento de marcha temperatura prolongado o insufficiereducción de marcha temperatura nt. Cambio ascendente temperatura prolongada no se recomienda ya que esto activa el E. coli respuesta de choque térmico 15, que puede inhibir la actividad de protelomerase e interferir con la estabilidad del plásmido. Por lo tanto, el momento de la reducción de marcha temperatura es un paso fundamental para la producción MiniString eficiente. Sin tiempo de incubación adicional a 30 ° C, se encontró MiniString eficiencia de la producción a ser muy pobre ( "Extracción temprano", Figura 3). Esto se puede atribuir a la cantidad de tiempo requerido para la expresión y la actividad Tel. El originario profago PY54 codificación Tel protelomerase normalmente infecta a Yersinia, que crece de forma óptima alrededor de 28 ° C 12, lo que indica que 30 ° C también puede ser más óptimo para la actividad Tel.
El sistema de producción minivector ADN utiliza una plataforma in vivo para generar minivectors ADN libre de secuencias bacterianas de alta calidad. Las modificaciones al protocolo de mayo iNCLUDE alterando el medio de cultivo para optimizar el plásmido y la producción de proteínas con el fin de promover el crecimiento celular durante la fase de crecimiento (TB en lugar de LB), o aumentar MiniString eficiencia de la producción y la conversión. Para volúmenes más grandes de cultivo (200 ml) y una mayor reducción de marcha, la temperatura y la incubación a 30 ° C durante la noche puede ser extendida sin graves repercusiones sobre la Ministring PE. Hemos incluido modificaciones en nuestro protocolo de cultivos de 500 ml como un ejemplo. Purificación de ministrings de ADN se puede acelerar a través de la digestión in vitro de endonucleasa de la columna vertebral procariota. Hay un número de sitios diana de endonucleasas (por ejemplo, PI-SceI, PvuI, ScaI) disponibles en la columna vertebral del plásmido procariota precursor, que puede ser cortado para exponer lineal extremos abiertos, lo que permite la degradación in vitro de la columna vertebral procariota. Aislamiento de ministrings de otras especies de vectores también se puede lograr a través de cromatografía de membrana de intercambio aniónico 16.
Una limitación de corriente asociado con el sistema de producción de vector de ADN LCC es la necesidad de la purificación de la MiniString ADN de otros productos de LCC y CCC. Aunque fácilmente purificado utilizando métodos de aislamiento de plásmidos estándar, la etapa de aislamiento todavía puede ser una desventaja en un entorno a gran escala. La separación de la MiniString puede llevar mucho tiempo utilizando la edad si el MiniString y la columna vertebral procariota LCC son muy similares en tamaño. Como alternativa, la cromatografía de membrana de intercambio aniónico puede proporcionar una mejor separación de ministrings a partir de especies de vectores CCC 16. Cambio ascendente de la temperatura puede ser otra limitación potencial como altas temperaturas también activan la respuesta de choque térmico en E. coli, que afecta negativamente a la proteína recombinante produce 17 y por lo tanto reducir las tasas de plásmido a Ministring conversión. Se presenta en otro lugar optimizaciones de la plataforma de producción para eludir y / o mitigar esos efectos de choque térmico 18. NosotrosActualmente también se están optimizando los métodos para eliminar o reducir la contaminación LCC columna vertebral procariota in vivo.
integración cromosómica del ADN MiniString LCC interrumpe el cromosoma del huésped y somete la célula a la apoptosis. Esto no sólo reducir posibles consecuencias negativas de la mutagénesis de inserción, tales como la oncogénesis y el silenciamiento de genes adyacentes, mejorando de este modo su seguridad; el efecto letal también puede servir como un método ideal para knock-in y estudios de sustitución de genes, sin los efectos secundarios asociados y daños de la integración. Vectores MiniString ADN se pueden aplicar a la transferencia y expresión de genes para proteínas terapéuticas, ARN, anticuerpos o antígenos en un objetivo determinado in vivo o sustituir un alelo funcional mal- o no. El simple inducible por calor en el sistema de producción in vivo de una sola etapa permite vectores MiniString ADN para ser producidos fácilmente para aplicaciones clínicas o industriales.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) para financiar este trabajo.
E. coli W3NN | Mediphage | strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012 | |
pDMS.IRES.GFP | Mediphage | parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS) | |
BD™ Difco™ Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244620 | |
Fisher BioReagents™ Terrific Broth | Fisher Scientific | BP2468500 | |
BD™ Bacto™ Dehydrated Agar | Fisher Scientific | 214010 | |
Ampicilin | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
Ultrapure Milipore Water | Fisher Scientific | Z00Q0V0US | Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System |
Surgical Gloves | VWR | (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
Fisherbrand™ Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
30 mL KIMAX® Test Tubes | VWR | 89001-448 | |
Spectrophotometer Cuvette | Sarstedt | 67.74 | |
Sterile 15 mL Falcon Tubes | BD Falcon | 62406-200, | |
Sterile 50 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 2930-S0 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 mL | BD Falcon | 13-675-20 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 mL | BD Falcon | 13-668-2 | |
Micropipettor (100-1000 μL) | FroggaBio | C1000-1 | |
Micropipettor (20-200 μL) | FroggaBio | C200-1 | |
Sterile Pipette Tips (100-1250 μL) | VWR | 89079-472 | |
Sterile Pipette Tips (1-200 μL) | VWR | 89079-460 | |
Fisher Scientific Economy Burner | Fisher Scientific | 03-917Q | |
Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
Sterile Erlenmeyer Flask (125 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (250 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (500 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 335901 | Model: Genesys 10 Vis |
Floor Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | Model: Avanti J-E |
Benchtop Centrifuge | Beckman | 362114 | Model: GS-6R |
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |