The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.
בנינו ליניארי הסגור קוולנטית (LCC) DNA minivectors כחלופת וקטור שאינו ויראלי גן-משלוח המיוצרת באמצעות פלטפורמה פשוטה in vivo. Ministrings DNA בעל פרופיל בטיחות מוגבר וגם ביעילות ולספק מטען DNA אל תאים ממוקדים. וקטורי DNA קונבנציונליים לבצע רצפים פרוקריוטים רצויים, כוללים גנים עמידים לאנטיביוטיקה, מוטיבי CPG, ומקורותיה בקטריאלי של שכפול, דבר שעלול להוביל לגירוי של תגובות חיסוניות מארח. הזמינות הביולוגית של וקטורי DNA קונבנציונליים נפגעת גם בשל הגודל המולקולרי הגדול שלהם. טבעו המעגלי שלהם עשוי גם להקנות אינטגרציה כרומוזומליות, שמוביל mutagenesis insertional.
רצפים חיידקית הם נכרתו מן minivectors DNA, ומשאירים רק את הגן של עניין (ממשלת ישראל) ואלמנטי ביטוי איקריוטיים צורך. minivectors DNA LCC שלנו, או ministrings DNA, הם נטולי רצפים חיידקי immunogenic; ולכן שיפור הזמינות ביולוגית EIR וביטוי ממשלת ישראל. במקרה של שילוב וקטור לתוך הכרומוזום, ministring DNA LCC יהיה קטלני לשבש את כרומוזום המארח, ובכך להסיר את המוטציה המסוכנת מן אוכלוסיית התא מתרבה. כתוצאה מכך, ministrings DNA מציע את היתרונות של DNA 'minicircle' תוך ביטול פוטנציאל אירועי אינטגרצית וקטור רצויים. בהשוואה פלסמידים קונבנציונאלי וסגר עגול isogenic שלהם קוולנטית (CCC) עמיתיהם, ministrings DNA להפגין הזמינות הביולוגית מעולה, יעילות transfection, קינטיקה ציטופלסמית – הם כן הם דורשים כמויות נמוכות של חומרים פעילי שטח קטיוני עבור transfection יעילה של תאים היעד.
בנינו-צעד אחד מושרה במערכת vivo לייצור ministrings דנ"א coli Escherichia כי הוא פשוט לשימוש, מהיר, וניתן להרחבה.
המטרה היא לייצר כמויות להרחבה של ליניארי סגור קוולנטית (LCC) minivectors ה- DNA באמצעות מושרה חום צעד אחד יעילות פשוט גבוהה מערכת ייצור in vivo DNA ministring. ministrings DNA לספק אסטרטגיה שאינה ויראלי בטוחה ויעילה להעביר דנ"א. הם משלבים את הבטיחות של וקטורי LCC עם היעילות של minicircles DNA, וגם להציע חלופה בטוחה יותר וקטורים הנגזרים וירוס מבלי להתפשר יעילות transfection.
על מנת מערכת המסירה transgene כדי להצליח, וקטור DNA חייב להיכנס לתא היעד המארח ולהביע את הגן המקודד (ים). ישנן מספר מחסומי הסלולר שצריכים להתגבר בפועל, במיוחד במערכות יונקות. כדי למנוע שפלה ידי nucleases בסרום וזיהוי חיסוני על ידי מערכת reticulo-אנדותל, וקטור DNA חייב להיות ביו וחסין-תואם עם מערכת היעד. DNA לא מוגנים מתעכל מהר ידי nucleases פלזמהואת קרום פלסמיד מורכב מחסומים ליפופרוטאין צפופים כך וקטור DNA חייב להיות מסוגל לחצות את קרום התא במהירות של תאי יעד. לאחר בתא, וקטורים חייבים לחצות את הציטופלסמה ולהעביר דרך קרום הגרעין להיכנס לגרעין לביטוי transgene. טכניקות למסירת הגן ללא ויראלי להתמקד שיפור של רקמות ותא מיקוד. עם זאת, השימוש של פלסמידים קונבנציונאלי עם טכניקות אלו מפחית יעילות transfection בשל נוכחותם של רצפים חיידקי immunogenic, אשר במהירות משתיק ביטוי גנים 1,2. פלסמידים קונבנציונלי בדרך כלל לשאת גנים עמידים לאנטיביוטיקה לצורך התחזוקה במערכות פרוקריוטים. עם זאת, אלה עשויים לייצר השפעות שליליות אפשריות ב מארחי אדם או להקנות עמידות המתרחשים מארח צומח טבעי באמצעות אפקטי העברת גנים אופקיים. פלסמידים קונבנציונלי גם מכילים מוטיבים CPG dinucleotide 2, אשר יכול לעורר תגובה immunostimulatory רצויות, באופן פוטנציאליצמצום ביטוי transgene או השתקה.
כפי שהם מורכבים אך ורק של קלטת ביטוי איקריוטיים, DNA minivectors, כגון דנ"א minicircles 3, הם אלטרנטיבה טובה יותר עבור משלוח גן כפי שהם מציגים שיפור זמינות ביולוגית תאית ו תאי ביטוי גנים משופר בשל הגודל המופחת שלהם ואת העדר אלמנטים פרוקריוטים immunostimulatory 4. פארס גודל הווקטור המופחת טוב יותר ביחס התנגדות לכוחות גזירה הקשורים in vivo ממשל אתר יעד 5. מספר העותק הגבוה של הווקטור לכל המוני יחידה דורש הגיב transfection פחות, ובכך להקטין רעילות. עם זאת, במקרה של שילוב וקטור אקראי לתוך כרומוזום מארח, מעגלי סגור קוולנטית (CCC) וקטורים, כולל שני minicircles דנ"א פלסמידים קונבנציונלי, להקנות המשכיות מולקולרית ועל כן היא עשויה להוביל mutagenesis insertional, אשר יכולה להיות השלכות הרסניות <sעד> 6. יחסית, שילוב של וקטור DNA ליניארי משבש את כרומוזום ויוזמת מסלולים מוות של תאים, ובכך להסיר את התא מוטציה מן האוכלוסייה תא מתרבים ומניעת mutagenesis insertional 7. ביטוי גנים Minimalistic מוגדר אימונולוגית (מידג ') וקטורים 8 ו וקטורים ליניארי מיקרו 9 (MiLV) הם וקטורים LCC דנ"א שפותח במבחנה. וקטורי מידג הפגינו עד ביטוי transgene השתפר 17 פי in vivo בהשוואה ל- DNA פלסמיד הקונבנציונלי וקטורי 11, ו הראו תוצאות מבטיחות 10 חיסון ריפוי גנטי לסרטן 8. בנוסף, בשל מבנה פיתול חינם של minivector LCC, מגיב transfection נדרש פחות בהשוואה למקבילו supercoiled CCC, ובכך להקטין רעילות 7.
וקטורים DNA LCC משופרת שלנו, ministrings DNA, הוכיחו יעילות ביטוי מעולה bioavaiלביליונים 7. יתר על כן, ministrings DNA מיוצר על מערכת ייצור חום-מושרה צעד אחד in vivo, חלופה כדאית וחסכונית וקטורי מידג ו MiLV LCC, הדורשים שלבים מרובים במבחנה. מערכת ייצור DNA ministring להיות הפגינה היא תהליך חום מושרה פשוט בצע in vivo, מה שהופך אותו הן חסכונית וניתן להרחבה בקלות. מערכת זו מנצלת את תל PY54 הנגזר בקטריופאג enterocolitica Yersinia / PAL protelomerase מערכת רקומבינציה 12 להפריד את קלטת ביטוי איקריוטיים המינימאלית מן שדרת פלסמיד פרוקריוטים. יש לנו מהונדסים Escherichia coli תאים (W3NN) להביע תל protelomerase תחת שליטה של האמרגן λ בקטריופאג חום מושרה, CI [Ts] 857 13. עם הביטוי, תל protelomerase פועלת באתרים PAL היעד הנוכחי בתוך "רצף סופר" (SS) אתרים הממוקמים על פלסמיד מבשרכדי להניב מוצרי LCC, שממנה ministring DNA יכול להיות מטוהר אז (איור 1). האתרים SS על פלסמיד מבשר DNA ministring גם לקודד אתרי היעד recombinases אחרים כולל Cre recombinase (לקס), TelN protelomerase (telRL) ו FLP recombinase (FRT), ובכך מקלות על ייצור של LCC isogenic ו CCC minivectors מן הפלסמיד מבשר אחד. בנוסף, כל אתר SS הוא מוקף משני עברי רצפים משפרים SV40 (SV40e), המשמשים לשיפור טרנסלוקציה גרעין 14. אנחנו הוכחנו במקום אחר כי בנוסף רצוף של SV40e בהדרגה מקנה עליות המקבילה יעיל transfection 7. הפלסמיד המבשר (pDNA MiniString או PDMS) מכיל polylinker (איור 1) כדי להקל על כניסה של כל גן רצוי של עניין היתוך תעתיק עם כתב הניאון הירוק (GFP).
הטכנולוגיה DNA minivector רשאילשמש מקום של שיטות קונבנציונליות עבור העברת גנים, ביטוי של גני כתב, והערכות לקראת יעילות ביטוי transgene במערכות איקריוטיים. ministrings DNA לשלב את biocompatibility והטבות יעילות transfection מוגברת של וקטורים "מיני" עם פרופיל בטיחות מעולה של וקטורים DNA ליניארי. פלטפורמת הפקת הצעד אחד החזקה שלנו במהירות ובקלות מייצרת ministrings DNA עבור כל יישום העברת גנים ומציעה פרופיל בטיחותי גבוה.
אנו מתארים כאן שיטה פשוטה לייצור ministrings LCC DNA באמצעות פרוטוקול חום מושרת צעד אחד, שאינו דורש שום ציוד מיוחד מלבד זה אשר משמש התפתחות חיידקים טיפוסית ומניפולציה. ministrings DNA הם נטול פיתול, קלטות ביטוי ה- DNA ליניארי יציבות, נטולות אלמנטים גנטיים פרוקריוטים. הם עשויים לשמש מקום של שיטות קונבנציונליות עבור העברת גנים, ביטוי של גני כתב, כמו גם בהערכות לקראת יעילות ביטוי transgene במערכות איקריוטיים. ministrings DNA לשלב את biocompatibility והטבות יעילות transfection מוגברת של וקטורים "מיני" עם פרופיל בטיחות מעולה של וקטורים DNA ליניארי. הצעד האחד החזק שלנו ב לפלטפורמת הפקת vivo במהירות ובקלות מייצר ministrings DNA עבור כל יישום העברת גנים ללא הצורך בתהליכים במבחנה יקר רבים.
ישנם מספר צעדים קריטייםלהבטיח ייצור ministring אופטימלי (איורים 2 ו -3). אינדוקציה החום הוא השלב הקריטי ביותר כדי ministring הייצור. חוסר מוחלט של ministring הייצור הוא ככל הנראה בשל חוסר אינדוקציה (תאי שמר על 30 מעלות צלזיוס), שבו דיכוי הביטוי protelomerase מונע ההמרה של פלסמיד מבשר ministring LCC. בעקבות פרוטוקול האינדוקציה, מצפה יעיל ייצור של כ 75%. אינדוקציה חומה היא אופטימלית תוך תאים נמצאים בשלב יומן. למרות שאין הבדל משמעותי סטטיסטית ministring PE בעת שימוש תאים בשלב נייח ( "מגודל", איור 3), עשינו להשקיף כמעט ירידה של 50% בתשואה פלסמיד הכולל. תשואות תהיינה תלויות בפרוטוקול חילוץ פלסמיד המשמש. לייצור ministring אופטימלי, לעורר השראה חומה תוך תאים נמצאים בשלב יומן. ייצור ministring מסכן יהיה ככל הנראה בעקבות upshift הטמפרטורה ממושכת או insufficiedownshift הטמפרטורה NT. טמפרטורת upshift הממושכת היא מיואשת כמו זה מפעיל את ה בתגובת הלם חום coli 15, אשר עשוי לעכב פעילות protelomerase ולהפריע יציבות פלסמיד. לכן, תזמון downshift הטמפרטורה היא עוד שלב קריטי לייצור ministring יעיל. בלי זמן הדגירה נוסף על 30 מעלות צלזיוס, יעילות הייצור ministring נמצאה להיות מאוד עלוב ( "הסרת מוקדמת", איור 3). זה ניתן לייחס את כמות הזמן הנדרשת עבור ביטוי תל ופעילות. Protelomerase תל קידוד שמקורם prophage PY54 בדרך כלל מדביק Yersinia, אשר גדל בצורה אופטימלית סביב 28 מעלות צלזיוס 12, המציין כי 30 ° C יכול להיות גם אופטימלי יותר לפעילות תל.
מערכת ייצור DNA minivector מנצל פלטפורמה in vivo כדי ליצור minivectors רצף ה- DNA ללא חיידקים באיכות גבוהה. שינויים בפרוטוקול יורשה ליnclude לשנות את התקשורת צמיחה לייעל פלסמיד וייצור חלבון כדי להאיץ גדילת תאים במהלך שלב הצמיחה (TB במקום LB), או להגדיל ministring יעילות הייצור וההמרות. עבור אמצעי אחסון תרבות גדול יותר (200 מ"ל ו יותר), downshift הטמפרטורה הדגירה על 30 מעלות צלזיוס ניתנת להארכה לילה ללא השפעה שלילית חמורה על ministring PE. כללנו שינויים בפרוטוקול שלנו עבור 500 מ"ל תרבויות כדוגמה. טיהור ministrings DNA יכול להיות מזורזת דרך עיכול במבחנה endonuclease של עמוד השדרה פרוקריוטים. ישנם מספר אתרי יעד endonuclease (למשל, PI-SCEI, PvuI, SCAI) נגיש עמוד השדרה פרוקריוטים של פלסמיד המבשר, אשר ניתן לחתוך לחשוף ליניארי פתוח מסתיים, המאפשר שפל במבחנה של עמוד השדרה פרוקריוטים. בידוד של ministrings ממיני וקטור אחרים יכול גם להיות מושג באמצעות כרומטוגרפיה קרום אניוני 16.
מגבלה הנוכחית אחת הקשורים למערכת ההפקה וקטור LCC DNA הוא הצורך לטיהור של ministring DNA ממוצרים LCC ו CCC אחרים. למרות מטוהרים בקלות באמצעות שיטות בידוד פלסמיד סטנדרטיות, צעד הבידוד עדיין יכול להיות חסרון באווירה בקנה מידה גדולה. ההפרדה של ministring יכול להימשך זמן רב באמצעות AGE אם ministring ועמוד השדרה פרוקריוטים LCC דומות מדי בגודל. לחלופין, כרומטוגרפיה קרום אניוני עשויה לספק הפרדה טובה יותר של ministrings ממיני וקטור CCC 16. Upshift טמפרטורה יכול להיות אחרת הגבלה פוטנציאל כמו טמפרטורות גבוהות גם מפעיל את התגובה להלם חום ב E. coli, אשר משפיע באופן שלילי חלבון רקומביננטי מניב 17 ולהפחית עקב שיעורי פלסמיד ministring המרה. אנו מדווחים במקום אחר אופטימיזציות של פלטפורמת ההפקה לעקוף ו / או להפחית תופעות כאלה של חום הלם 18. אָנוּגם הם אופטימיזציה שיטות כרגע למנוע או להפחית LCC זיהום עמוד השדרה פרוקריוטים in vivo.
אינטגרציה כרומוזומלית של ministring DNA LCC משבש את כרומוזום מארח ומשעבד התא לאפופטוזיס. לא זו בלבד להפחית תוצאות שליליות אפשריות של mutagenesis insertional כגון oncogenesis והשתקה של גנים סמוכים, ובכך לשפר את הבטיחות שלה; האפקט הקטלני גם יכול לשמש ככלי עזר אידיאליים-ב דפיקה ומחקרי החלפת הגן ללא תופעות הלוואי הקשורות והניזק של אינטגרציה. וקטורים DNA ministring יכול להיות מיושם כלפי ההעברה ואת הביטוי של גנים עבור חלבונים תרופתיים, RNA, נוגדנים, או אנטיגנים לתוך יעד נתון in vivo או להחליף אלל פונקציונלי רַע או אי. החום-מושרה צעד אחד פשוט במערכת הייצור vivo מאפשרת וקטורי ministring DNA להיות מיוצרים בקלות ליישומים קליניים או תעשייתיים.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) למימון עבודה זו.
E. coli W3NN | Mediphage | strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012 | |
pDMS.IRES.GFP | Mediphage | parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS) | |
BD™ Difco™ Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244620 | |
Fisher BioReagents™ Terrific Broth | Fisher Scientific | BP2468500 | |
BD™ Bacto™ Dehydrated Agar | Fisher Scientific | 214010 | |
Ampicilin | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
Ultrapure Milipore Water | Fisher Scientific | Z00Q0V0US | Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System |
Surgical Gloves | VWR | (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
Fisherbrand™ Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
30 mL KIMAX® Test Tubes | VWR | 89001-448 | |
Spectrophotometer Cuvette | Sarstedt | 67.74 | |
Sterile 15 mL Falcon Tubes | BD Falcon | 62406-200, | |
Sterile 50 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 2930-S0 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 mL | BD Falcon | 13-675-20 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 mL | BD Falcon | 13-668-2 | |
Micropipettor (100-1000 μL) | FroggaBio | C1000-1 | |
Micropipettor (20-200 μL) | FroggaBio | C200-1 | |
Sterile Pipette Tips (100-1250 μL) | VWR | 89079-472 | |
Sterile Pipette Tips (1-200 μL) | VWR | 89079-460 | |
Fisher Scientific Economy Burner | Fisher Scientific | 03-917Q | |
Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
Sterile Erlenmeyer Flask (125 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (250 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (500 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 335901 | Model: Genesys 10 Vis |
Floor Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | Model: Avanti J-E |
Benchtop Centrifuge | Beckman | 362114 | Model: GS-6R |
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |