Een hoog gehalte Imaging Assay voor Identificatie van botulineneurotoxine Remmers
Summary
Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.
Abstract
Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.
Introduction
De bacterie Clostridium botulinum produceert Botulinum neurotoxine, een van de meest potente biologische toxinen die de mens 1. Er zijn 7 verschillende BoNT serotypen (BoNT / AG). BoNT / A-Gall induceren verlamming bij de neuromusculaire junctie door SNARE complex proteolyse 2,3. SNARE proteolyse voorkomt neurotransmitter blaasje-membraan fusie en daardoor blokkeert de exocytose van neurotransmitters 4. De specifieke SNARE doel hangt af van de specifieke BoNT serotype betrokken bij de intoxicatie proces. BoNT / A en BoNT / E cleave SNAP-25 terwijl BoNT / C splitst zowel SNAP-25 en syntaxine 5. De overblijvende serotypen splitsen synaptobrevine (ook wel bolletjes geassocieerde membraaneiwit (VAMP). BoNT / A is gekozen assay ontwikkeling is verantwoordelijk voor een groot deel van natuurlijk voorkomende botulisme en de langste werkingsduur 6. Ontwikkeling van moleculen geneesmiddelen tegen BoNT / A is een belangrijk doel vooronze drug discovery programma en heeft traditioneel-target-gebaseerde methoden gebruikt om de actieve site proteolytische remmers 7 identificeren, 8-10. Echter, zal de oprichting van de actieve site inhibitoren met breed spectrum activiteit tegen verschillende serotypes en post-exposure werkzaamheid waarschijnlijk uitdagend.
We hebben daarom werd een innovatieve, fenotypische drug discovery aanpak die BoNT SNAP-25 splitsing gebruikt als een functionele eindpunt aan kleine moleculen die BoNT-gemedieerde motor neuron intoxicatie kan blokkeren identificeren. SNAP-25 is nodig voor neurotransmitters, zoals afbraak van SNAP-25 is voorspellend verlamming en letaliteit in vivo. Bijvoorbeeld zou celgebaseerde screening tot ontdekking van nieuwe modulatoren van cellulaire factoren die verantwoordelijk zijn voor toxine inactivering of remming van toxine trajecten binnen doelcellen. Een belangrijke factor in fenotypische assay ontwikkeling is de selectie van fysiologisch relevante biologische modellen. We en anderen hebben muis embryonale stamcellen (ES) cellen afgeleide motorische neuronen die de immunologische karakter van de primaire motorische neuronen recapituleren en het uiten van Onverwacht-25 11- 13 beschreven. Belangrijk, deze cellulaire systemen zijn zeer gevoelig voor BoNT / A intoxicatie en tonen dosis-afhankelijke splitsing van SNAP-25 in reactie op toenemende concentraties van toxine 11,12. De gedifferentieerde neuronen worden ook geproduceerd in hoeveelheden die voldoende zijn voor high throughput plaat gebaseerde analyse en kon de vormgeving van een array van cellulaire assays.
De fenotypische test is een immunofluorescentie methode gebruik te maken van twee verschillende antilichamen tegen splitsing van endogeen tot expressie volledige lengte SNAP-25 te kwantificeren tijdens BoNT / Een roes van muis motor neuron cultuur. Een carboxyleindstandige BoNT / A decollete-gevoelige (BACS) antilichaam dat alleen volledige lengte SNAP-25 herkent, worden nagegaan of BoNT / A gemedieerde proteolyse van SNAP-25uitdrukking in muismotorneuronen 10. Een schematisch diagram van de HCI assay is weergegeven in figuur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hoge potentie van botulinum neurotoxinen en het relatieve gemak van hun bewapening heeft geresulteerd in hun indeling in categorie A (hoogste prioriteit) biothreat agenten door de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention. Helaas zijn er geen FDA goedgekeurde therapieën voor BoNT intoxicatie tegen nadat het toxine wordt geïnternaliseerd door de motorneuronen. Elke druggable mechanisme neuronale herstel van BoNT intoxicatie bevordert leiden naar de ontwikkeling van een potentiële therapie voor zowel he…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Botulinum neurotoxin A | Metabiologics | NA | No catalog number |
| Microtitre plates | Greiner | 655946 | Poly-D-Lysine 96-well plates |
| BACs antibody | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Methanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini Automated Workstation | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X 100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII tubulin antibody | R&D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
Riferimenti
- Lamanna, C. The most poisonous poison. Science. 130, 763-772 (1959).
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. J. Infect. Dis. , (2013).
- Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin. Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).
- Yersin, A., et al. Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).
- Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).
- Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense. Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).
- Nuss, J. E., et al. Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies. Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).
- Opsenica, I., et al. A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus. Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).
- Opsenica, I., et al. The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease. European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).
- Nuss, J. E., et al. Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease. ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).
- Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem cell research. 6, 195-205 (2011).
- Pellett, S., et al. Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A. Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).
- McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).
- Fischer, A., et al. Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).
