Ein hoher Gehalt Imaging Assay zur Identifizierung von Botulinum Neurotoxin-Inhibitoren
Summary
Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.
Abstract
Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.
Introduction
Das Bakterium Clostridium botulinum produziert Botulinum Neurotoxin, einem der potentesten biologischen Giftstoffen auf den Menschen bekannt 1. Es gibt 7 verschiedene BoNT-Serotypen (BoNT / AG). BoNT / A-Gall induzieren die Lähmung an der neuromuskulären Synapse durch SNARE-Komplex Proteolyse 2,3. SNARE Proteolyse verhindert Neurotransmitter-Vesikel-Membranfusion und damit Blöcke Exozytose von Neurotransmittern 4. Die spezifische SNARE Ziel ist abhängig von der jeweiligen BoNT Serotyp im Rausch Prozess beteiligt. BoNT / A und BoNT / E spalten SNAP-25 in der Erwägung, BoNT / C spaltet sowohl SNAP-25 und Syntaxin 5. Die verbleibenden Serotypen spalten Synaptobrevin (auch Vesikel-assoziiertes Membranprotein (VAMP) genannt. BoNT / A wurde für die Assay-Entwicklung gewählt, da es einen hohen Anteil von natürlich vorkommenden Botulismus verantwortlich und hat die längste Wirkdauer. 6 die Entwicklung des kleinen Moleküls Therapeutika gegen BoNT / A ist ein wichtiges Ziel fürunsere Wirkstoffforschungsprogramm und hat die traditionelle Zielbasierte Methoden genutzt, um aktive Zentrum proteolytischen Inhibitoren 7 identifizieren, 8-10. Jedoch wird die Schaffung von aktiven Zentrum Inhibitoren mit breiten Wirkungsspektrum gegen mehrere Serotypen und Postexpositions Wirksamkeit wahrscheinlich schwierig sein.
Daher haben wir eine innovative, phänotypische Wirkstoffforschungsansatz, BoNT SNAP-25-Spaltung als funktionelle Endpunkt an kleine Moleküle, die BoNT-vermittelten motorischen Neurons Intoxikation blockieren identifizieren können verwendet implementiert. SNAP-25 ist für die Freisetzung von Neurotransmittern erforderlich, wie Abbau von SNAP-25 ist prädiktiv für Lähmung und Letalität in vivo. Zum Beispiel könnten zellbasierte Screening zur Entdeckung neuer Modulatoren zellulärer Faktoren für Toxin Inaktivierung oder Hemmung der Toxin-Bahn-Innere Zielzellen verantwortlich führen. Ein wichtiger Faktor bei der phänotypischen Assay-Entwicklung ist die Auswahl der physiologisch relevanten biologischen Modellen. We und andere haben embryonalen Stammzellen (ES) Zellen abgeleiteten Motorneuronen, welche die immunologischen Charakter des primären Motoneuronen zu rekapitulieren, einschließlich der Expression von SNAP-25 11- 13 beschrieben. Wichtig ist, dass diese zellulären Systeme sind sehr empfindlich auf BoNT / A-Intoxikation und zeigen Dosis-abhängige Spaltung von SNAP-25 in Reaktion auf ansteigende Konzentrationen des Toxins 11,12. Das differenzierte Motorneuronen sind ebenfalls in Mengen, die ausreichend für die Hochdurchsatzanalyse basiert Platte sind, und erlaubt die Konstruktion einer Reihe von zellulären Assays hergestellt.
Die phänotypische Assay ist ein Immunfluoreszenzverfahren, das zwei verschiedene Antikörper zur Spaltung der endogen exprimierten voller Länge SNAP-25 während der BoNT / A Rausch der Maus Motor Neuron Kultur quantifizieren. Ein carboxylterminalen BoNT / A-Spaltung empfindlichen (BACS) Antikörper, der nur in voller Länge SNAP-25 erkennt erlaubt die Beurteilung von BoNT / A vermittelten Proteolyse von SNAP-25Expression in der Maus Motoneuronen 10. Ein schematisches Diagramm des HCl-Assay ist in 1 dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hohe Wirksamkeit von Botulinum Neurotoxine und der relativen Leichtigkeit ihrer Bewaffnung hat in ihrer Einstufung als Kategorie A (höchste Priorität) biothreat Agenten von den US Centers for Disease Control and Prevention geführt. Leider gibt es keine von der FDA zugelassenen Therapeutika zur BoNT-Intoxikation zu begegnen, nachdem das Toxin von den Motoneuronen verinnerlicht worden. Alle druggable Mechanismus, der neuronalen Wiederaufnahme von BoNT-Intoxikationen fördert könnte in Richtung der Entwicklung eine…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Botulinum neurotoxin A | Metabiologics | NA | No catalog number |
| Microtitre plates | Greiner | 655946 | Poly-D-Lysine 96-well plates |
| BACs antibody | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Methanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini Automated Workstation | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X 100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII tubulin antibody | R&D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
Riferimenti
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