نفيدكم تقنية لتصنيع micropockets داخل الأغشية electrospun للدراسة سلوك الخلية. على وجه التحديد، ونحن تصف مزيج من microstereolithography وelectrospinning لإنتاج PLGA (بولي (lactide-CO-glycolide)) أجهزة بيولوجية القرنية مجهزة microfeatures.
مشاكل القرنية تؤثر على الملايين من الناس في جميع أنحاء العالم خفض نوعية حياتهم إلى حد كبير. يمكن أن يكون سبب مرض القرنية من الأمراض مثل انعدام القزحية أو متلازمة ستيفن جونسون، فضلا عن العوامل الخارجية مثل الحروق الكيميائية أو الإشعاع. العلاجات الحالية هي (ط) استخدام الطعوم القرنية و (ب) استخدام الخلايا الجذعية توسعت في المختبر وتسليمها في ناقلات (مثل الغشاء الذي يحيط بالجنين). هذه العلاجات الناجحة نسبيا ولكن للأسف أنها يمكن أن تفشل بعد 3-5 سنوات. هناك حاجة إلى تصميم وتصنيع الأجهزة الجديدة مادة بيولوجية القرنية قادرة على تقليد بالتفصيل البيئة الفسيولوجية حيث توجد الخلايا الجذعية في القرنية. تقع الخلايا الجذعية الحوفي في حوف (منطقة دائرية بين القرنية والصلبة) في قطاعات محددة تعرف باسم الحواجز من فوغت. في هذا العمل قمنا بتطوير تقنية المنصة الجديدة التي تجمع بين اثنين من تقنيات التصنيع المتطورة (microstereolithography وelectrospinnجي) لتصنيع أغشية القرنية التي تحاكي إلى حد ما حوف. الأغشية لدينا تحتوي على micropockets اصطناعية والتي تهدف إلى توفير حماية الخلايا مع مثل الحواجز من فوغت القيام به في العين.
القرنية، واوعائي المركزية معظم الأنسجة الخارجية للعين، هو واحد من الأنسجة أهم المشاركين في الرؤية 1. هناك عدة أنواع من الخلايا التي تحافظ على وظيفة القرنية. الطبقة الخارجية العليا من القرنية تتكون من خلايا الظهارية التي يمكن أن تكون في حوالي 5-7 طبقات سماكة 2. هذه الطبقة تمنع الغزو البكتيري في القرنية 3 وتسمح بدخول الأكسجين 4. وقد أفيد أن الخلايا الجذعية تكمن ظهارة القرنية في محاريب أو أقبية (مع أحجام 120-150 ميكرون) في المنطقة الطرفية من القرنية المعروفة باسم حوف 5،6. كما تنقسم الخلايا الجذعية، وخلايا ابنة المعروف أيضا باسم خلايا تضخيم عابرة السفر من محاريب ويستمر انقسام الخلايا وتتحرك centripetally الداخل والناجمة صعودا في خلايا متباينة عضال في المنطقة القرنية المركزية 7،8. يتم محو هذه الخلايا بشكل روتيني بعيدا مع طرفة العين الإلكترونيةxposing الخلايا الجديدة تحت 9.
بالإضافة إلى كونه موقع الخلايا الجذعية الظهارية، حوف أيضا يلعب دورا في الحفاظ على الملتحمة أوعية دموية بعيدا عن المنطقة القرنية 10. يمكن أن يكون سبب الأضرار التي لحقت حوف بواسطة الحروق الحرارية / الكيميائي والإشعاع والأمراض الوراثية أيضا 10. عندما يحدث هذا، هو كسر حاجز حوف أسفل السماح للخلايا الملتحمة للتحرك على القرنية، vascularizing المنطقة، مما تسبب الألم والعمى في بعض الحالات. ومن المعروف أن الشرط كما نقص الخلايا الجذعية الحوفي (LSCD) 10.
وقد تم الإبلاغ عن ركائز طبيعية مختلفة ممكن ناقلات الخلايا الجذعية للمساعدة في تجديد القرنية. على سبيل المثال، تم استخدام الأغشية القائم على الكولاجين بواسطة درافيدا وآخرون 11 وراما وزملاء العمل 12 ذكرت استخدام الليفين في الدراسة 112 مرضى. في الوقت الحاضر ولكن الطريقة الأكثر شيوعا للعلاجهو استخدام الغشاء الذي يحيط بالجنين البشري من بنك الأنسجة والثقافة الخلايا الظهارية الحوفي على سطحه 13،14. مرة واحدة وقد شكلت أحادي الطبقة، يتم لصقها الغشاء الذي يحيط بالجنين جانب خلية حتى على القرنية المتضررة، والتي لديها كل خلايا الملتحمة وندبا ازالتها جراحيا منه قبل ذلك زرع الخلايا 14. ويتحلل الغشاء الذي يحيط بالجنين في غضون أسابيع أو شهور تاركة الخلايا الظهارية التي تعلق على منطقة الجرداء لتجديد البشرة 15،16. وكان هذا الأسلوب ناجحا في استعادة الرؤية ولكن لا يزال هناك عدد قليل من القضايا العملية التي تقيد امتصاص على نطاق واسع سريريا. كما الغشاء الذي يحيط بالجنين والأنسجة البشرية التي يحتاج للخضوع لفحص الأنسجة باستخدام إجراءات مصرفية جيدة قبل استخدامها لزرع الخلايا في المرضى. هذا الفحص يقلل فقط من خطر انتقال الأمراض ولكن لا يمكن القضاء عليه تماما 17. وبالإضافة إلى ذلك كانت هناك تقارير من التباين في صerformance من الغشاء الذي يحيط بالجنين بسبب أمور الاختلاف 18،19 المانحة وطرق المعالجة المختلفة 19،20. إلى جانب خطر صغير من انتقال المرض هناك شرط المراكز الجراحية في الحصول على بنوك الأنسجة التي تتمتع بإدارة جيدة، وليس المتاحة للجميع.
على الرغم من أن الغشاء الذي يحيط بالجنين ناجحا نسبيا، وهناك حاجة لتطوير البدائل الاصطناعية القابلة للتحلل الناقل خلية جديدة لعلاج مرض القرنية. ان ناقلات الاصطناعية التغلب على الحاجة إلى الإجراءات المصرفية، فضلا عن القضاء على خطر صغير من انتقال المرض وتقلبه بين الجهات المانحة. في هذا المعنى، وقد درست مواد مثل البولي ايثيلين جلايكول 21،22 و 23،24 PLGA.
على إيجاد بديل اصطناعي لغشاء يحيط بالجنين البشري هناك أيضا إمكانية لتصميم فيه ميزات مرغوبة للمساعدة نأمل بقاء الخلايا المستزرعة. والمؤتمر الوطني العراقيlusion من microfeatures داخل أجهزة بيولوجية لمراقبة معينة من سلوك الخلية هو المجال الناشئ للاهتمام. وأفادت العديد من المؤلفين العمل نحو تطوير خلايا جذعية مصطنعة الكوات 25-30. وقد ذكرت هذه المجموعة مؤخرا إنشاء PEGDA-biofunctionalized فبرونيكتين حوف الاصطناعي microfabricated لإيصال الخلايا الظهارية الحوفي 22 و منهجية لتصنيع الأغشية القابلة للتحلل electrospun تحتوي على جيوب microfabricated لدعم الخلايا الظهارية الحوفي 31.
الهدف من هذا العمل هو تطوير تقنية التصنيع الجديدة لتطوير الأجهزة التي تحتوي على مادة بيولوجية microfeatures التي تحاكي إلى حد ما في microenvironments فيها الخلايا الجذعية الموجودة في الجسم. قمنا بتطوير الأسلوب الذي يجمع بين microstereolithography وelectrospinning التي تسمح للتصنيع الأغشية microstructured القابلة للتحلل التي تظهر العظمى!ر إمكانات التطبيقات تجديد الأنسجة.
من المهم أن نلاحظ أنه على الرغم من تم تطبيق هذه التقنية في هذا العمل إلى تلفيق من حلقات عن تجديد القرنية، والتكنولوجيا يمكن تطبيقها على تصنيع أجهزة لتجديد مجموعة واسعة من الأنسجة الطلائية، مثل الجلد، عن طريق الفم الظهارة المخاطية والأمعاء والجهاز التنفسي، والمثانة. على وجه التحديد، في هذه الدراسة قمنا بتطوير غشاء القابلة للتحلل الاصطناعية التي تعمل بطريقة مماثلة لالغشاء الذي يحيط بالجنين لتقديم الخلايا القرنية. يحتوي هذا الغشاء micropockets حوالي 300 ميكرون (أكبر من الخبايا الحوفي من Pallisades من فوغت (حوالي 150 ميكرون)). أخيرا، قمنا بتأسيس بروتوكول التعبئة والتغليف والتي تسمح هذه الأغشية ليتم تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة أكثر من 6 أشهر دون أن تظهر أي علامات على انهيار.
توضح هذه الدراسة (أ) تقنية لتصنيع الأغشية electrospun microfeatures تحتوي داخلها و (ب) كيفية تحضير هذه الأغشية للاستخدام السريري بواسطة التعبئة فراغ، وأشعة جاما ثم التخزين قبل استخدامها. في هذا التطبيق معينة قمنا بتطوير أغشية PLGA تحتوي micropockets التي تحاكي الميزات المادية للالحوفي محاريب الخلايا الجذعية. أهداف هذه الدراسة هي (ط) لوصف طرق لتزويد القراء بالمعرفة اللازمة لتصميم وتصنيع السقالات التي تحتوي على microfeatures للبحث في مساهمة محاريب الخلايا الجذعية لتجديد أنسجة و (ii) لتزويد القارئ بفهم أفضل كيفية تخزين السقالات electrospun لفترات طويلة من الزمن.
من حيث التطبيق السريري، تخزين الأغشية الدائري هو من أهمية قصوى. في هذا العمل، تم دراسة تدهور حلقة على مدى فترة 6 أشهر. تدهوروالدافع الأغشية قبل التحلل ذلك ببساطة عن طريق الحفاظ على الأغشية وتوقف المجانية الرطوبة العملية. بلاكوود آخرون ذكرت أن من خلال تغيير نسبة لجيش التحرير الشعبى الصينى PGA، وتدهور الغشاء يغير 32. وأظهرت هذه الدراسة أيضا أن زيادة كمية PGA، فإن معدل تدهور الأغشية electrospun زيادة في الجسم الحي 22. هنا وقد تبين أنه مع فراغ التعبئة الأغشية مع بعض المجففة واضاءة عليها وتخزينها لهم في درجات حرارة منخفضة لمدة 6 أشهر، ليس هناك تغيير في نزاهة الألياف وتدهورها. في الوقت الحاضر، 6 أشهر هي بقدر ما درسنا مع هذه الأغشية تحتوي على micropockets لكن تخزين البيانات لتم الإبلاغ 1 سنة على الأغشية electrospun العادي في -20 ° C 22 و لدينا الآن بيانات غير منشورة لتخزينها في -20 ° C لمدة 2 سنة من دون أي علامات التدهور. وبالتالي لتخزين على المدى الطويل وسيكون موضع أوصى لتخزينها في -20 الجاف6؛ C ولكن من الممكن تخزينها في RT حتى في الهند لمدة 6 أشهر على الأقل (ربما أكثر من ذلك بكثير). إدراج مؤشر الرطوبة يعطي وسيلة سهلة للتحقق من أن العبوة أبقت الأغشية الجافة في هذه الحالة سيكون لائقا لهذا الغرض.
وقد تبين نقل الخلايا من هذه الحلقات لنماذج 3D القرنية عند وضع إإكسبلنتس الحوفي داخل micropockets. وذكرت هذه المجموعة مؤخرا نقل الخلايا في المختبر على أرنب نموذج القرنية عن طريق وضع إإكسبلنتس على الأغشية PLGA العادي (الأغشية دون الهياكل حلقة) 24. باستخدام السقالات microfabricated نقل خلية الحالي قد اتخذت خطوة أبعد ويمكننا الآن تحديد موقع على وجه التحديد إإكسبلنتس الأنسجة داخل microfeatures. القدرة على وضع إإكسبلنتس مباشرة داخل محاريب أيضا يسمح للجراح لاستخدام الأغشية مباشرة في المسرح الجراحي تجنب الحاجة لغرف الأبحاث لتوسيع أولا الخلايا الجذعية الحوفي. على الرغم من أن هذه القطعة من العوقد تركز ك على تطوير أجهزة لمرض القرنية، ويمكن تطبيق هذه التكنولوجيا التصنيع الدقيق أيضا للأجهزة العديد من التطبيقات الأخرى النامية. والعمل المستقبلي استكشاف تصنيع التركيبات لتجديد الأنسجة الأخرى مثل الجلد والعظام.
في حين تصميم وتصنيع الأولي للPEGDA المجهرية يمكن أن يكون مضيعة للوقت، مرة واحدة ملفقة الهياكل يمكن إعادة استخدامها مرات عديدة دون تدهور. ولذلك، فإن تلفيق لاحقة من الأغشية القابلة للتحلل PLGA microstructured بواسطة electrospinning يمكن أن يؤديها بنفس المعدل لإنتاج العادي ('غير منظم') الأغشية التالية تجميع المجمع. على الرغم من أن في هذا العمل استخدمنا microstereolithography لافتعال قوالب وأساليب أخرى مثل تصنيع 3D الطباعة أو حقن صب يمكن أن تستخدم أيضا. وفقا لذلك، يمكن إجراء القالب الكامنة من البوليمرات أو المعادن الأخرى بدلا من PEGDA. ومثل هذه التقنية متعددة جدا، ويمكن أن تتكيف بسهولة الباحثين طريقة لتتناسب مع احتياجات والمرافق الخاصة بها.
وmicrostereolithography في المنزل انشاء المستخدمة في هذه الدراسة لن تسمح إعداد بنيات مع ميزات تحت 30μm. هذا ليس وجود قيود لتطبيق القرنية وصفها هنا ولكن يمكن أن يكون حاسما في تصميم نماذج أخرى. في هذه الحالة تقنيات أخرى مثل 2 الفوتون البلمرة (2PP) يمكن أن تكون ذات فائدة إلا أن تقنية electrospinning قد لا تسمح للاستنساخ الهياكل على مقياس الفرعي ميكرون (وهذا ما يجري حاليا دراستها من قبل مجموعتنا).
الخطوات الحاسمة في إطار عملية تصنيع هي (ط) تجنب overcuring من القوالب PEGDA التي يمكن التحكم فيها عن طريق ضبط الوقت وكميات photoinitiator. (ب) السيطرة على الأوضاع electrospinning مثل درجة الحرارة والرطوبة. (ج) تخزين مناسب electrospuالأغشية ن حلقة باستخدام فراغ التعبئة والمجففات.
وباختصار، من خلال وضع إإكسبلنتس الأنسجة الحوفي داخل microfeatures الغشاء أظهرنا ثمرة خلية من إإكسبلنتس على المناطق المتخصصة، ونقل الخلايا إلى أرنب جرح القرنية وإعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري لاحقة من القرنية. كما تم درس تدهور الأغشية المخزنة في درجات حرارة مختلفة، ولقد تم تطوير بروتوكول التعبئة والتغليف والتي تتيح تخزين على المدى الطويل من الأغشية، وهذا الأخير هو أساسي في تطوير أغشية للاستخدام السريري.
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.
Name of reagents/material/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Poly lactic-co-glycolic acid | Purac | PDLG5004 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser |
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250g/mol 500 ml |
DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
Ham’ s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
EGF | R&D | 236-EG-200 | |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
gamma- irradiation (Sterilisation) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) – external dose range of 25-40KGy | N/A | |
Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
Copper (II) sulphate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | N/A | |
Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | N/A | |
Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | N/A | 3% |